猪组织中氟尼辛残留检测方法研究

摘要

氟尼辛为动物专用的非甾体抗炎药(NSAIDs)，在兽医临床上常用其葡甲胺盐(FM)，主要通过抑制花生四烯酸合成链中的环氧化酶，来减少前列腺素和血栓烷素等炎性介质的生成，而有效地缓解机体的发热、疼痛和炎症。
　　EMEA和FDA相继规定了猪可食组织中氟尼辛的最大残留限量，而中国却未制定其MRL。同时，国内外针对猪可食组织中氟尼辛残留量的检测方法报道的很少，且方法存在重现性差、操作繁琐、灵敏度低等缺陷。随着FM在畜牧生产中的广泛使用，从食品安全角度考虑，建立一种可靠的猪可食组织中氟尼辛残留量的检测方法是非常有必要的。
　　本研究目的是建立一种可靠、快速、灵敏的UPLC-MS/MS检测方法，应用于猪可食组织（肌肉、皮脂、肝脏、肾脏）、血浆、尿液、粪便中氟尼辛残留量检测，同时将该方法应用于氟尼辛在猪体内残留消除试验和代谢试验的研究。主要研究结果如下:
　　1.猪可食组织中氟尼辛残留检测方法的建立
　　建立了一种可靠、快速、灵敏的UPLC-MS/MS方法用于猪肌肉、皮脂、肝脏、肾脏组织中氟尼辛的残留检测。本实验选用乙酸乙酯-乙腈(1∶1，V/V)对组织中的待测物进行提取，Oasis MCX固相萃取柱净化，Acquity UPLC BEH C18色谱柱梯度洗脱，肉标法定量。在电喷雾正离子模式(ESI+)下选择多反应监测(MRM)模式进行分析。方法在猪肌肉、皮脂、肝脏、肾脏组织中的检测限(LOD)和定量限(LOQ)分别为0.5μg·kg-1和1μg·kg-1;在1～200μg·kg-1浓度范围内，峰面积与浓度呈良好的线性关系(R2＞0.999);待测物的回收率为73.7～124.3％，日内精密度及日间精密度＜17.8％。
　　2.猪血浆、尿液、粪便中氟尼辛残留检测方法的建立
　　建立了一种可靠、快速、灵敏的UPLC-MS/MS方法用于猪血浆、尿液、粪便中氟尼辛的残留检测。本实验选用乙腈对血浆进行提取;乙腈-2％磷酸溶液(1∶4，V/V)对尿液进行提取，Oasis MCX固相萃取柱净化;乙酸乙酯-乙腈(1∶1，V/V)对粪便进行提取，Oasis MCX固相萃取柱净化，Acquity UPLC BEH C18色谱柱梯度洗脱，内标法定量。该方法在血浆中的LOD和LOQ分别为0.25μg·L-1和0.5μg·L-1;尿液中分别为0.25μg·L-1和0.5μg·L-1;粪便中分别为0.5μg·kg-1和1.0μg·kg-1。在0.5～500μg·kg-1（或μg·L-1）浓度范围内，峰面积与浓度呈良好的线性关系(R2＞0.999);待测物的回收率分别为68.9～118.6％,日内精密度及日间精密度＜18.3％。
　　3.氟尼辛在猪可食组织中残留消除试验研究
　　27头健康猪被随机分为5个给药组（每组5头）和1个空白对照组（1公1母），给药组猪按2.2 mg·kg-1（以氟尼辛计）的剂量肌肉注射FM注射液，一日一次，连续给药3天，空白对照猪不做处理。在最后一次给药后第0.5、6、11、16、23天各屠宰5头给药猪，第7天屠宰2头空白对照猪，收集组织样品，匀浆后保存。使用已建立的UPLC-MS/MS检测方法，进行消除试验研究。结果表明:本研究建立的UPLC-MS/MS检测方法成功地用于猪可食组织中氟尼辛残留消除研究。健康猪注射给以氟尼辛，在最后一次给药后第16天，各种组织中的氟尼辛浓度都低于最大残留限量(MRL);在第23天时几乎检测不到该药物。对本试验得到的数据采用休药期计算软件WT1.4计算的猪肌肉、皮脂、肝脏、肾脏、注射位点肌肉、注射位点皮脂组织的休药期分别为5.15d、23.37 d、9.78 d、19.70 d、18.72 d、26.76 d。
　　4.氟尼辛在猪体内代谢试验研究
　　9头健康猪被随机分为1个给药组（4公3母）和1个空白对照组（1公1母），给药组猪按2.2 mg·kg-1（以氟尼辛计）的剂量肌内注射FM注射液，一日一次，连续给药3天，空白对照猪不做处理。收集血浆、尿液、粪便样品，混匀后保存。使用已建立的UPLC-MS/MS检测方法，测定血液、尿液、粪便中的氟尼辛的残留量，进行代谢试验研究。结果显示:本研究建立的UPLC-MS/MS检测方法成功地用于猪可食组织中氟尼辛残留消除研究。健康猪注射给以氟尼辛，对最后一次给药后收集的血药浓度-时间数据进行分析，确定半衰期(t1/2λz)为7.37±1.60 h，达峰时间(tmax)为0.57±0.19h，达峰浓度(Cmax)为2.79±1.29μg·mL-1;大约有6.9±1.6％和1.9±0.4％的给药量以氟尼辛原型分别随尿液和粪便排出体内。

目录

论文说明

声明

摘要

缩略符号

引言

第一章 文献综述

1．1 氟尼辛简介

1．2 理化性质

1．3 作用机理

1．4 毒理学研究

1．5 药动学研究

1．6 临床应用

2 氟尼辛残留研究进展

2．1 氟尼辛最高残留限量的规定

2．2 氟尼辛样品前处理

2．3 氟尼辛残留检测方法

2．4 氟尼辛残留消除研究和休药期

3 研究内容及目标

3．1 研究内容

3．2 研究目标

参考文献

第二章 猪可食组织中氟尼辛残留检测方法的建立

1．1 材料

1．2 试验方法

2 结果与讨论

2．1 色谱条件的优化

2．2 质谱条件的优化

2．3 前处理方法的优化

2．4 方法学考察

3 本章小结

参考文献

第三章 猪血浆、尿液、粪便中氟尼辛残留检测方法的建立

1．2 试验方法

2 结果与讨论

2．1 液相色谱条件的优化

2．2 质谱条件的优化

2．3 前处理方法的优化

2．4 方法学考察

3 本章小结

参考文献

第四章 氟尼辛在猪可食组织中残留消除试验研究

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 试验方法

2 结果与讨论

2．1 猪可食组织中氟尼辛残留消除试验结果

2．2 休药期的确定

3 本章小结

参考文献

第五章 氟尼辛在猪体内代谢试验研究

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 试验方法

2．结果与讨论

2．1 血浆中氟尼辛试验结果

2．2 尿液、粪便中氟尼辛试验结果

3 本章小结

参考文献

全文结论

致谢

攻读硕士期间发表的论文