比较重组牛野生型和突变型脂多糖结合蛋白对脂多糖诱导的牛乳腺上皮细胞的影响

摘要

脂多糖结合蛋白(lipopolysaccharide binding protein，LBP)对识别细菌成分，比如脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，发挥重要的作用。本实验通过真核表达系统获得体外重组牛脂多糖结合蛋白（recombinant bovine lipopolysaccharide binding protein，RBLBP），包括野生型LBP(wild LBP，WT-LBP)和突变型LBP(mutant LBP, MU-LBP)。体外培养牛乳腺上皮细胞(bovine mammary epithelial cells，BMECs)，并用LPS诱导细胞炎症反应，用不同浓度的RBLBP处理炎症细胞，并用MTT法检测细胞存活率和流式细胞术检测细胞凋亡率。通过基因芯片技术比较WT-LBP和MU-LBP对体外培养的乳腺上皮细胞在基因转录水平上的不同影响。本次研究对进一步探讨突变LBP在奶牛乳房炎的作用以及防治有重要的作用。
　　本实验分为三个部分:
　　1 RBLBP的表达与纯化
　　本实验在哺乳细胞表达系统获得重组的野生型和突变型LBP，为后续实验提供材料。首先，从基因库中查找目标蛋白野生LBP和第三外显子发生点突变(4619 G→A)的突变LBP的cDNA序列。合成设计好的目的基因。其次，将LBP基因亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1上，构建重组质粒，并测序验证其正确性。最后，利用转染剂将重组质粒转入哺乳细胞HEK293，通过瞬时表达产生LBP蛋白，去除内毒素，通过SDS-PAGE和Western-blot检测并验证LBP蛋白的正确性。结果表明，正确构建了重组表达质粒，重组质粒成功转入哺乳动物细胞中，获得纯化的WT-LBP和MU-LBP。
　　2体外培养BMECs并且比较WT-LBP和MU-LBP对由LPS诱导的炎症细胞存活率和凋亡率的影响
　　本实验目的是检测不同浓度的RBLBP对由LPS诱导的炎症BMEC的存活率和凋亡率的影响，依此探究出对细胞存活率和凋亡率的影响相对较大的RBLBP浓度，为后续的基因芯片实验提供依据。结果显示，用不同浓度的RBLBP（1，5，10和15μg/mL）处理炎症上皮细胞12小时，结果显示5μg/mL的RBLBP能够增加由LPS诱导的炎症细胞的凋亡率，并且MU-LBP比WT-LBP能够诱导更高的细胞凋亡率。结果表明，5μg/mL的RBLBP能够使细胞的炎症反应更剧烈，因此我们选用5μg/mL的RBLBP作为基因芯片实验的进一步实验。
　　3基因芯片技术比较WT-LBP与MU-LBP对炎症乳腺上皮细胞在基因转录水平上的影响
　　LBP具有致炎和抗炎双重作用，发挥何种功能则是依赖于血液中LBP浓度和其自身独特的分子结构及功能位点。用相同浓度（5μg/mL）且不同蛋白类型的RBLBP处理由LPS诱导的炎症细胞，用基因芯片技术比较WT-LBP与MU-LBP对细胞炎症在基因转录水平上的差异性。基因芯片技术和生物信息学分析的结果显示，在由5μg/mL的MU-LBP处理的炎症细胞和未用LBP处理的炎症细胞之间差异表达的基因有2306个。与此同时，在由5μg/mL的WT-LBP处理的炎症细胞和未用LBP处理的炎症细胞之间差异表达的基因是1585个。这些表明相同浓度的RBLBP，MU-LBP比WT-LBP能使细胞的炎症反应更剧烈，与之前实验结果即相同浓度的MU-LBP比WT-LBP使炎症细胞的凋亡率更高的结果一致。GO和KEGG分析结果显示这些差异表达的基因参与到不同的调节炎症反应的信号通路中。因此，我们预测携带这种突变型LBP的个体感染阴性菌后具有引起更强的炎症反应的风险。

目录

论文说明

声明

摘要

常用缩略词(Abbreviation)

前言

第一章 文献综述

1．奶牛乳房炎

1．1 细菌与奶牛乳腺炎

1．2 乳腺炎的炎症反应

2．LBP分子的相关研究进展

2．1 LBP的发现

2．2 LBP的来源及结构

2．3 LBP的功能

2．4 LBP的基因突变

第二章 重组牛脂多糖结合蛋白(RBLBP)的体外表达与纯化

1．实验材料

1．1 表达载体和细胞株

1．2 主要试剂

1．3 主要仪器

1．4 主要配方

2．实验方法

2．1 目标基因全基因合成

2．2 目标基因亚克隆到哺乳动物细胞表达载体

2．3 哺乳动物细胞培养，蛋白表达和纯化小试

3．实验结果

3．1 重组蛋白氨基酸序列

3．2 载体的构建及鉴定

3．3 目标蛋白的表达与纯化

4．讨论与总结

第三章 RBLBP对LPS诱导的炎症乳腺上皮细胞活力的影响

1．材料与方法

1．1 材料

1．2 主要试剂

1．3 主要仪器

1．4 试验方法

2．测定指标及方法

2．1 实验分组及细胞处理

2．2 MTT法检测LBP对细胞的毒性

2．3 乳腺上皮细胞存活率检测

2．4 奶乳腺上皮细胞凋亡率检测

3．数据分析

4．结果

4．1 奶牛乳腺上皮细胞形态学观察及鉴定

4．2 RBLBP对乳腺上皮细胞的毒性检测

4．3 RBLBP对由LPS诱导的炎症乳腺细胞存活率和凋亡率的影响

4．讨论

5．小结

第四章 比较WT-LBP和MU-LBP对乳腺上皮细胞在基因转录水平上的差异

1．实验材料

1．1 材料

1．2 试剂

1．3 仪器与软件

1．4 实验分组

2．试验方法

2．1 奶牛乳腺上皮细胞的培养与纯化

2．2 样本准备

2．3 RNA抽提和纯化

2．4 芯片实验

3．RNA水平验证芯片结果

3．1 细胞总RNA的提取

3．2 RNA甲醛变性琼脂糖凝胶电泳

3．3 紫外分光光度法测定总RNA的含量和纯度(OD260／OD280)

3．4 反转录(RT)

3．5 实时荧光定量PCR反应

4．结果

4．1 总RNA样本质控信息

4．2 芯片实验质控情况

4．6 差异表达基因

4．7 GO注释和KEGG信号通路富集分析

4．8 差异基因的qPCR验证

5 讨论

6．小结

全文结论

实验创新点

攻读硕士期间发表论文

致谢

参考文献