产纤维蛋白酶和淀粉酶抑制剂放线菌Streptomyces sp.CC5的筛选及其产物的特性研究

摘要

放线菌是一类具有菌丝、主要以孢子繁殖的革兰氏阳性原核生物，其形态分化是原核生物中最为复杂的一类，具有球状、杆状、分支状等多种形态。放线菌广泛分布于不同的自然环境之中，可产生多种天然活性物质，是一类具有广泛实际用途和巨大经济价值的微生物资源。放线菌产生的活性产物包括抗菌物质、酶、酶抑制剂、抗氧化剂等，广泛应用于医药、农业和工业等领域。
　　本论文经过对不同生境土壤样品中的放线菌进行分离筛选，并通过菌落形态观察、16S rRNA基因酶切分型去重复、16S rRNA基因测序的方法对所分离到的放线菌进行菌属归类，同时从淀粉酶抑制剂和纤维蛋白酶两个主要角度寻找其发酵上清液中具有生物活性的代谢产物。最终从来源于全国40个土样中一共分离出10个属，406株放线菌，包括:链霉菌属(Streptomyces)，野野村菌属(Nonomuraea)，小单孢菌属（Micromonospora），小双孢菌属(Microbispora)，诺卡氏菌属（Nocardia），假诺卡氏菌属（Pseudonocardia），马杜拉菌属（Actinomadura），动单孢菌属(Planomonospora)，分支杆菌属（Mycobacterium）和小链孢菌属（Catellatospora）。通过碘和淀粉显色法、α-gal-G2-CNP法以及纤维蛋白平板法分别从中筛选出18株放线菌发酵液具有纤维蛋白水解活性和10株放线菌发酵液具有淀粉酶抑制活性。
　　其中Streptomyces sp.CC5可以同时产生高活性的纤维蛋白酶和α-淀粉酶抑制剂，并产生纤溶酶原激活剂和抗菌物质等天然活性产物。纤维蛋白酶可以直接快速溶解血栓，用于心血管疾病的治疗，其中对急性心肌梗塞、肺栓塞等急性血栓效果更加明显。通过大孔树脂吸附、凝胶离子交换树脂脱色素、硫酸铵分级沉淀和Superdex200凝胶层析等方法从CC5菌株发酵液中分离纯化到一种对纤维蛋白具有较强水解活性的碱性丝氨酸蛋白酶AfeE，其分子量为29984 Da。通过肽指纹图谱分析和基因克隆技术获得全长为1305 bp的基因(afeE)。结合高分辨率质谱和信号肽分析，发现AfeE可能存在翻译后加工的现象。afeE共编码434个氨基酸，前36个氨基酸为信号肽，在尾部320G-321T位之间被未知蛋白酶特异切割，成熟肽AfeE由中间的284个氨基酸组成，与源于S.griseus的氨肽酶(SGAP)有80％的相似性，但部分生化性质与SGAP存在明显不同。A feE的最适反应条件范围为40℃，pH7.0-12.0，表明AfeE为碱性蛋白酶。苯甲基磺酰氟(PMSF)、大豆胰蛋白酶抑制剂(SBTI)、N-甲苯磺酰-L-赖氨酰-氯甲基酮(TLCK)和甲苯磺酰-L-苯丙氨酸氯甲基酮(TPCK)对AfeE均有很强的抑制效果，说明A feE为丝氨酸蛋白酶;此外，AfeE可以使蛋白酶抑制剂亮肽素失活，说明AfeE可能属于亮肽素失活蛋白酶。Cu2+，Co2+和Zn2+可以部分抑制酶活。AfeE具有一定的底物水解特异性，对纤维蛋白的水解速率明显快于对纤维蛋白原、牛血清蛋白、血红蛋白和卵清蛋白的水解速率，对纤维蛋白原的水解方式为Aα链＞Bβ链＞γ链。AfeE在含有纤溶酶原的纤维蛋白平板上呈现的水解活性大于在纤溶酶原失活的纤维蛋白平板上的活力，说明AfeE可能还存在纤溶酶原激活活性。
　　利用动物实验对AfeE抗血栓性能进行评估。通过角叉菜胶诱导的小鼠尾部血栓模型溶栓实验结果表明:剂量为0.5 mg/kg AfeE的溶栓效果强于剂量为20 mg/kg尿激酶的溶栓效果，说明AfeE具有很强的溶栓活力。在抗凝实验中，AfeE对大鼠血浆凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶时间(TT)均有明显的时间延长，8μg AfeE可使PT凝血时间超出计时范围(＞180 s)，4μg AfeE可使APTT凝血时间超出计时范围，TT只需2μg AfeE即可超出凝血时间计时范围，表明AfeE具有很强的抗凝血能力。小鼠出血时间实验表明，注射剂量为1 mg/kg的AfeE对小鼠断尾出血时间没有明显影响，而阳性对照尿激酶组(20 mg/kg)出血时间显著延长，有40％的小鼠出血时间超出1800 s。这一结果表明相比尿激酶，AfeE可能存在较低的出血风险。细胞毒性实验表明，320μg/孔AfeE（大约相当于单只小鼠溶栓剂量的32倍）对所培养的人脐带静脉内皮细胞没有剧烈毒性。一系列初步的抗血栓评估实验表明AfeE具有较强的溶栓活性，对出血时间和细胞活性无明显影响，具有成为一种新型溶栓药物的潜能。
　　α-淀粉酶抑制剂可以特异抑制α-淀粉酶的活力，可作为生物杀虫剂控制以谷物等淀粉类作物为食的害虫;在医药上可以用于减缓餐后肠道对淀粉的消化，从而减慢机体对糖分吸收，降低血糖，普遍用于Ⅱ型糖尿病和肥胖的预防与治疗。通过大孔吸附树脂、离子交换、硫酸铵分级沉淀和Superdex75凝胶层析等一系列分离纯化手段从CC5菌株中分离到一种蛋白源α-淀粉酶抑制剂AAI-CC5。MALDI-TOF分析显示AAI-CC5分子量为8212 Da;N端前15个氨基酸序列为DTGSPAPECVEYFQS，和已报道的蛋白源淀粉酶抑制剂序列不同。AAI-CC5可以特异抑制哺乳动物来源的α-淀粉酶活力，未检测到对链霉菌、解淀粉芽孢杆菌、粘细菌和大蜡螟源淀粉酶的抑制活性。AAI-CC5对热及酸碱环境稳定，在pH2.0-10.0处理24 h或80℃处理1h均未检测到明显抑制活力丧失;在沸水浴20分钟内依然可以保持一半的抑制活性。根据N端序列分析和数据库相关蛋白序列比对分析，利用染色体步移技术克隆到AAI-CC5的编码基因aaiE，aaiE共编码110氨基酸，前34个为信号肽，后76个为成熟肽AAI-CC5,与来源于S.parvulus的Parvulustat有82％的相似性，属于WRY修饰的蛋白类淀粉酶抑制剂，这一类淀粉酶抑制剂的抑制活力是已报道的淀粉酶抑制剂中抑制活性最强的类群之一。AAI-CC5对猪胰腺淀粉酶的半抑制浓度IC50和抑制常数Ki分别为6.43×10-11和4.45×10-11。AAI-CC5成功在大肠杆菌中异源表达，重组淀粉酶抑制剂rAAI-CC5分子量为9404 Da，其抑制活性和稳定性与野生菌中分离获得的基本一致。

目录

声明

摘要

符号与缩略语说明

前言

第一章 文献综述

1．2 放线菌分类

1．3 放线菌：天然活性物质的生物合成工厂

2．1 血栓疾病简介

2．2 血栓形成

2．3 凝血与溶血基本原理

2．4 纤维蛋白酶治疗血栓策略

2．5 微生物来源纤维蛋白酶的探索

3 放线茵源α-淀粉酶抑制剂研究进展

3．1 非蛋白质类α-淀粉酶抑制剂

3．2 蛋白类α-淀粉酶抑制剂

4 本研究的意义与立题依据

参考文献

第二章 土壤中放线菌资源收集与活性物质的筛选

第一节 放线菌的分离及初步鉴定

1 材料与方法

2 结果

第二节 菌株CC5的相关菌种性质鉴定

1 材料与方法

2 结果

本章讨论

本章小结

参考文献

第三章 Streptomyces sp．CC5中纤维蛋白酶AfeE的分离纯化和基因克隆

第一节 纤维蛋白酶的分离纯化

1 材料与方法

2 结果

第二节 纤维蛋白酶AfeE的酶学性质评估及基因克隆

1 材料与方法

2 结果

本章讨论

本章小结

参考文献

第四章 纤维蛋白酶AfeE溶栓活性评估

1．1 实验材料

1．2 实验方法

2 结果

2．1 角叉菜胶诱导的鼠尾血栓模型对AfeE溶栓活性评估

2．2 AfeE抗凝活性研究

2．3 小鼠出血实验

2．4 细胞毒性实验

本章讨论

本章小结

参考文献

第五章 α-淀粉酶抑制剂AAI-CC5的分离鉴定及克隆表达

1 材料与方法

2 结果

第二节 AAI-CC5基因克隆与表达

1 材料与方法

2 结果

本章讨论

本章小结

参考文献

全文总结

主要创新点

不足之处与今后工作设想

附录

攻读博士学位期间学术成果

致谢