柳枝稷7个DREB1家族基因分析和DREB1C提高植物耐盐的功能验证

摘要

柳枝稷（Panicum virgatum）是一种重要的能源植物和水土保持植物。通过研究柳枝稷的抗逆机理，挖掘其抗逆调控基因，可进一步提高柳枝稷的产量、品质及其适应性，并为其他作物的品种改良提供抗逆基因资源。DREB/CBF是调控植物非生物胁迫的重要转录因子家族，对植物抵御盐、干旱、低温等多种逆境胁迫具有重要作用。
　　本实验对柳枝稷7个DREB1家族基因进行了初步分析，通过在烟草中过表达PvDREB1C基因，发现转PvDREB1C基因可以提高其耐盐性。主要研究结果如下:
　　(1)克隆了柳枝稷DREB1家族的7个同源基因，并对其氨基酸序列进行比对。结果表明它们均存在保守的AP2结构域，且在该结构域的上下游分别存在核定位信号序列和DSAW/R保守序列;C端存在保守的LWSY序列。由此可见，克隆的7个同源基因均具有DREB1转录因子家族的典型保守序列。
　　(2)将7个PvDREB1s基因与水稻、拟南芥直系同源基因进行了系统进化分析，按照其与水稻中同源基因的亲缘关系，分别命名为PvDREB1A-1/-2，PvDREB1B-1/-2，PvDREB1C和PvDREB1G-1/-2。
　　(3)通过点突变获得一系列含有不同数目的两种DRE作用元件(GCCGAC或ACCGAC)的rd29A启动子。通过GUS活性测定，估算了7个PvDREB1s对含有不同DRE元件的rd29A启动子的激活能力，从而判断7个PvDREB1s对两种DRE核心序列的识别偏好性。
　　(4)通过在烟草中过表达PvDREB1C基因，提高了转基因烟草幼苗对盐胁迫的耐受性。转基因烟草的鲜重、叶绿素含量、渗透势均显著高于野生型，而过氧化氢(H2O2)、超氧阴离子（O2-）含量均明显低于野生型。
　　(5)在200mMNaCl处理下，转基因烟草成苗的鲜重、株高、茎粗、叶绿素含量、Fv/Fm均显著高于野生型，叶片相对电解质渗漏率显著低于野生型;叶片的抗氧化酶活性（SOD、POD和APX）均显著高于野生型;与抗氧化相关的下游基因NtSOD、NtPOD、与离子转运相关基因NtNHX4、与渗透调节相关基因NtERD10B的表达量均显著高于野生型;Na+含量、Na+/K+比值显著低于野生型。由此可见，PvDREB1C可以直接或间接调控植物抗氧化系统、离子转运和渗透调节的主效基因，从而提高了转基因烟草的耐盐性。

目录

声明

摘要

略缩词表

引言

第一章 文献综述

1 能源植物柳枝稷

2 DREB／CBF转录因子及其研究进展

2．1 转录因子

2．2 DREB／CBF类转录因子的特点及其研究进展

2．3 转DREB1／CBF基因提高植株抗逆性

3 植物与逆境

3．1 植物对逆境的响应

3．2 植物的耐盐性

4 研究目的与意义

第二章 七个柳枝稷PvDREB1家族基因的表达及识别DRE序列偏好性分析

1 材料与试剂

1．1 植物材料

1．2 实验试剂

2 实验方法

2．1 柳枝稷PvDREB1s基因荧光定量表达实验

2．2 柳枝程PvDREB1s同源基因的克隆及表达载体的构建

2．3 柳枝稷PvDREB1s与rd29A启动子突变体结合活性测定

2．4 数据分析

3．结果与分析

3．1 柳枝稷PvDREB1家族同源基因序列分析

3．2 柳枝稷PvDREB1家族基因在逆境条件下的表达分析

3．3 柳枝稷PvDREB1s转录因子与rd29A启动子中不同DRE顺式作用元件结合活性分析

4．讨论

第三章 PvDREB1C过表达烟草的转化及其耐盐功能分析

1 材料与方法

1．1 烟草的遗传转化

1．2 转基因烟草的盐胁迫处理与生理生化指标测定

1．3 数据分析

2 结果与分析

2．1 转基因植株的获得

2．2 转基因烟草株系的验证

2．3 烟草幼苗的耐盐性分析

2．4 烟草成苗的耐盐性分析

3 讨论

3．2 转PvDREB1C基因提高了烟草对活性氧的清除能力，从而提高其耐盐性

3．3 PvDREB1C过表达减少了植物叶片中Na+的积累，提高其耐盐性

第四章 全文结论

参考文献

致谢

附录