PmrA/PmrB二元调控系统介导大肠杆菌对黏杆菌素的耐药机制

摘要

大肠杆菌作为人畜肠道菌群重要的一员，对维持肠道正常生理功能具有重要意义，但某些致病性大肠杆菌可引起动物腹泻，泌尿道感染等疾病，给养殖业造成巨大损失。近年来，多药耐药大肠杆菌的传播已经引起世界的广泛关注，黏杆菌素作为治疗大肠杆菌的最后一道防线又重新应用于临床，但同时黏杆菌素耐药株也开始在临床出现。本文对二元调控系统PmrA/PmrB介导大肠杆菌对黏杆菌素的耐药机制进行了初步探讨，旨在为有效控制耐药菌传播与扩散提供理论依据。
　　一、pmrA/pmrB突变对耐药大肠杆菌的影响
　　为探讨pmrA/pmrB突变是否介导大肠杆菌对黏杆菌素的耐药，本试验首先测定临床分离大肠杆菌对黏杆菌素的最低抑菌浓度(MIC)，然后通过step-wise方法进行体外诱导得到5株耐药菌（9R、36R、53 R、91R和107R），PCR扩增并连接T载体后对所有亲本株及耐药株pmrA/pmrB测序，同时对耐药菌的细胞膜特性（Zeta电位）、抗生素敏感性等进行分析。结果发现5株耐药菌MIC达到16μg·mL-1以上时，pmrB会发生点突变或插入突变，其中9R(G55A)、36R(T500 C)和53R(T263 A)菌株分别在55、500和263位发生点突变，91R(30 bp)和107R(189 bp)菌株分别在229和478位插入30 bp和189 bp，但所有耐药菌的pmrA未发生突变;所有耐药菌Zeta电位均极显著下降（P＜0.01）;不同耐药菌对头孢噻呋、庆大霉素、氟苯尼考、恩诺沙星和四环素的敏感性均有不同程度上升。此外，电镜结果显示黏杆菌素耐药菌细胞外膜缺失，对黏杆菌素具有抗性，而敏感菌经黏杆菌素处理后，细胞会破裂。同时本研究发现临床分离的耐药菌（MIC介于4～8μg·mL-1）的pmrA和pmrB均未发生突变，推测存在其它耐药机制，有待进一步揭示。
　　二、pmrA/pmrB回复突变株构建及pmrA/pmrB mRNA表达量测定
　　为进一步探讨诱导耐药菌株的pmrB插入片段是否是引起大肠杆菌对黏杆菌素耐药的关键因素，本试验在体外筛选得到带有pmrB插入片段的耐药菌(91R、107R)的基础上，采用red同源重组方法构建了这两株菌的pmrA/pmrB回复突变株，同时测定回复突变株的表型及pmrA/pmrB mRNA表达量变化。此外，通过荧光定量PCR检测所有耐药菌株pmrA/pmrB mRNA表达量变化。结果显示所有诱导耐药菌pmrA/pmrB的表达量均较亲本株高，其中发生点突变的三株耐药菌（9R、36R和53R）pmrA/pmrB的表达量均显著（P＜0.05）或极显著（P＜0.01）上升，而91R和107R菌株（含有插入片段）的pmrA/pmrB表达量虽有上升趋势但不显著（P＞0.05）。所有耐药菌株的回复突变株对黏杆菌素恢复敏感，pmrB表达水平显著下降至亲本株的表达水平(P＜0.05)，pmrA的表达量虽有下降趋势但变化不显著（P＞0.05）。
　　三、pmrA/pmrB突变对大肠杆菌体外适应性代价研究
　　在体外诱导获得带有突变位点耐药菌的基础上，本研究采用体外竞争试验，通过测定所有耐药菌及相应亲本株的生长曲线并根据生长动力学参数分析了pmrA/pmrB突变对大肠杆菌的适应性代价。结果显示，各耐药菌株最大生长速率均有上升趋势但变化不显著(P＞0.05)，36R、53R和91R菌株的生长世代时间均显著升高（P＜0.05），所有耐药菌的体外适应性较亲本株均极显著降低(P＜0.01)。
　　综上所述，pmrB点突变及插入突变伴随pmrA/pmrB高表达是介导大肠杆菌对黏杆菌素耐药的主要机制之一，耐药菌在细胞膜电位、基因表达等方面均有明显变化，同时pmrA/pmrB的突变及高表达对耐药菌造成适应性代价，表现为其体外竞争力较敏感菌低。

目录

论文说明

声明

摘要

缩略词表

引言

第一章 文献综述

第二章 pmrA／pmrB突变位点检测及耐药菌细胞膜特性分析

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果

2．1 临床分离株MIC测定结果

2．2 突变位点分析

2．3 Zeta电位测定

2．4 黏杆菌素处理对敏感菌与耐药菌形态影响

2．5 黏杆菌素耐药菌株对其它不同抗生素的敏感性

3 讨论

3．1 诱导耐药大肠杆菌中pmrA／pmrB突变位点分析

3．2 耐药性对大肠杆菌Zeta电位及细胞膜影响

3．3 黏杆菌素耐药菌对其它抗生素的敏感性

参考文献

第三章 pmrA／pmrB回复突变株的构建pmrA／pmrB mRNA表达水平的检测

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果

2．1 诱导耐药菌及临床耐药菌pmrA和pmrB mRNA表达变化

2．2 pmrA基因缺失及回复突变株的构建

2．3 pmrA基因缺失株及pmrB回复突变株中pmrA和pmrB mRNA表达

2．4 黏杆菌素对缺失株及回复突变株最低抑茵浓度测定

3 讨论

3．2 91R△pmrA pmrB mRNA表达及MIC变化

3．3 回复突变株pmrA／pmrBmRNA表达及MIC变化

参考文献

第四章 pmrA／pmrB突变对大肠杆菌适应性的影响

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果

2．1 各耐药菌与其相应敏感菌株生长曲线测定

2．2 各耐药菌及相应敏感株生长动力学参数

2．3 耐药菌与相应亲本株体外竞争试验

3 讨论

参考文献

全文总结

致谢

攻读硕士期间发表的论文