梭梭热激转录因子HaHsfA3、HaHsfB3的克隆、亚细胞定位和表达模式分析

摘要

温度是植物生长的三大必需条件之一，也是影响植物生长、发育的主要环境因子。高温胁迫会对植物生长发育带来伤害，培育耐热品种可以帮助植物更好地应对高温危害。而热激转录家族则是一类对于温度有敏感响应的转录家族，它所囊括的热激转录因子(Heat shock transcription factor，HSF)具有耐热、耐干旱等重要抗逆功能。梭梭（Haloxylon ammodendron），别名梭梭柴，是藜科(Chenopodiaceae)梭梭属（Haloxylon）多年生灌木或小乔木。主要分布在亚非大陆的热带及亚热带，生长在沙漠，盐渍地和砾质戈壁上，耐风蚀、耐干旱。本试验以梭梭植株为试验材料，克隆了2个热激转录因子HaHsfA3、HaHsfB3，该基因编码的蛋白被认为可以提高植物的抗高温能力。对这两个梭梭热激转录因子进行了生物信息学分析，并研究其编码蛋白的亚细胞定位。此外，为了研究热激转录因子在逆境下的功能，对梭梭进行高低温处理、干旱胁迫处理，分析其表达模式和生理响应。总之，本文从基因、生理水平研究了不同逆境下梭梭根、同化枝的调控机制。本论文的主要结果如下:
　　1.根据已测定的梭梭转录组测序结果，运用生物信息学方法鉴定梭梭热激转录因子基因HaHsFs，克隆出了梭梭热激转录因子HaHsfA3、HaHsfB3基因，其ORF长度分别为1083 bp和768 bp，编码361个和256个氨基酸，分子量为39.76 kDa和29.30 kDa，理论等电点为5.38和8.21，aHsfA3和HaHsfB3基因均具有热激转录因子特有的DNA结合域，二者编码的蛋白均为亲水性蛋白。构建的同源进化树表明:梭梭HaHsfA3与茄科HsfA3蛋白进化关系最近，而HaHsfB3与葫芦科HsfB3蛋白进化关系最近。
　　2.通过Softberry和WOLF PSORT网站预测，结果表明HaHsfA3、HaHsfB3蛋白定位在细胞核。根据预测结果，本实验构建了HaHsfA3、HaHsfB3基因的GFP-PA7载体，利用基因枪瞬时表达的亚细胞定位法，发现HaHsfA3、HaHsfB3基因编码的蛋白质均定位于细胞核。
　　3.对一月龄梭梭幼苗进行高温、低温、干旱胁迫，并在不同时间段取样，然后进行qRT-PCR分析，结果发现在不同胁迫下，HaHsfA3和HaHsfB3基因的表达模式有差异。45℃高温处理下，同化枝中HaHsfA3和HaHsfB3均呈现先上升、后下降的表达趋势，但Ha HsfA3的表达水平显著高于HaHsfB3。4℃低温处理下，同化枝中HaHsfA3和HaHsfB3均呈现先上升、后下降的表达趋势，这两个基因的表达均在1h达到最大。总的来说，Ha HsfB3基因的表达水平高于HaHsfA3。干旱处理下，同化枝中HaHsfA3和HaHsfB3的表达在1h达到最大，明显高于对照，1h后略高于对照。根中Ha HsfA3和HaHsfB3均明显的上调表达，Ha HsfA3先上升，于8h达到最大，然后经历一个下降再上升的过程，48 h的表达量略低于8 h;而HaHsfB3的表达量总体上一直呈现上升趋势，于48 h达到最大值。上述结果表明，同化枝和根中的HaHsfA3和HaHsfB3分别对高温、干旱的响应明显。
　　4.超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)、过氧化物酶(Peroxisome，POD)、过氧化氢酶(Hydrogen Peroxidase，CAT)作为抗氧化酶系统的重要组成部分，在植物耐旱过程中发挥着重要的作用。本试验测定了20％PEG模拟干旱胁迫梭梭幼苗中SOD、POD、CAT等酶活性以及丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量，发现梭梭幼苗中SOD、POD、CAT等酶活性在干旱处理下均呈现先上升后下降的趋势，而MDA的含量在4h内缓慢升高，而超过4h后急剧上升。这些结果表明:干旱胁迫初期，植物受到的干旱损害并不严重，此时植物体内抗氧化酶系统作用增强，SOD、POD、CAT等酶活性升高，清除活性氧，减轻活性氧对细胞膜等伤害，所以这时作为膜脂过氧化产物的MDA含量仅缓慢升高，维持在一个较低的水平。随着干旱胁迫的持续进行，对植物的损害加强，可能破坏了植物的正常生理代谢过程，对活性氧的清除能力减弱，抗氧化酶活性降低，同时对细胞膜造成严重损害，故MDA含量急剧上升。通过分析梭梭在干旱条件这些酶的活性和MDA含量的变化，初步解析梭梭抗旱的生理机制，可为以后梭梭耐旱性评价提供一定的数据支持。
　　本实验为荒漠地区重要的防风固沙植物梭梭的逆境响应相关基因的研究提供了资源为今后全面了解梭梭耐热的分子调控机制及利用分子育种手段培育出耐热的梭梭奠定了一定的基础。

目录

声明

摘要

缩略词

第一章 文献综述

1．1 梭梭的分类

1．2 梭梭的分布和形态特征

1．3 梭梭的生态和经济价值

1．4 梭梭的生理生态研究

1．5 梭梭的分子生物学研究

2．1 热激转录因子的起源

2．2 热激蛋白

2．3 热激转录因子的分类

2．4 热激转录因子的典型结构域

2．5 HSF的调控机制

2．6 热激转录因子的功能

2．7 热激转录因子亚细胞定位

3 热激转录因子在不同逆境胁迫下的研究进展

3．1 热激转录因子对高温下的响应

3．2 热激转录因子对低温的响应

3．3 热激转录因子对干旱的响应

4 本研究目的及意义

第二章 梭梭热激转录因子的克隆和序列分析

1．1 植物材料及其处理

1．2 药品及试剂

1．3 常用试剂及培养基配制

1．4 引物合成

2．1 RNA提取

2．2 RNA完整性检测

2．3 目的基因扩增

2．4 扩增产物的凝胶电泳、胶回收和连接

3 结果与分析

3．1 目的基因cDNA全长序列的分离

3．2 梭梭HaHsfA3和HaHsfB3基因的生物信息学分析

4 讨论

第三章 梭梭热激转录因子的亚细胞定位

1．1 实验材料

1．2 菌种、试剂和质粒

1．3 常用培养基和试剂

1．4 引物合成

1．5 实验方法

2 结果与分析

2．1 亚细胞定位载体构建结果

2．2 梭梭HaHsfA3、HaHsfB3蛋白的亚细胞定位结果

3 讨论

第四章 梭梭热激转录因子在逆境下的表达分析

1．1 实验材料

2 结果与分析

2．1 梭梭HaHsfA3、HaHsfB3基因在非生物胁迫下的表达分析

3 讨论

第五章 梭梭幼苗响应干旱逆境的生理基础

1 材料与方法

1．1 植物材料处理

1．2 主要试剂

1．3 试剂配制

1．4 测定方法

2 结果与分析

2．1 SOD活性的变化

2．2 POD活性的变化

2．3 CAT活性的变化

2．4 MDA含量的变化

3 讨论

全文总结

创新之处

参考文献

致谢