水稻钾离子转运蛋白基因影响生长发育和硝酸根吸收转运的作用机制

摘要

钾(K)作为植物的三大营养元素之一，是植物体内最大量的阳离子，在其众多生理生化过程中起重要作用。硝态氮是植物（包括水稻）从土壤中吸收的主要无机氮源，其从地下部向地上部的转运需要钾离子（K+）作为伴随离子来维持电荷平衡。植物对K+的吸收和转运主要是由K+通道与K+转运蛋白介导，其中钾转运蛋白在植物缺K条件下对K+的吸收及转运具有重要影响。在水稻中，KT/KUP/HAK是最大的K+转运蛋白家族，我们前期的研究结果表明，该转运蛋白家族成员OsHAK1与OsHAK5（Chen et al.，2015;Yang et al.，2014）在低K条件下对水稻K+吸收以及K+由根系向地上部的转运有着显著贡献，但是这两个蛋白的功能并不完全相同，OsHAK1偏重水稻K+吸收、而OsHAK5则偏重K+从地下向地上的转运。我们在多年的田间试验中发现，沉默（敲除）OsHAK1基因导致水稻根系生长受到抑制、有效分蘖减少、株高变矮并且结实率大幅降低。另外我们也发现无论在低K和高K供应情况下，该基因的敲除导致水稻中K+的含量（浓度）和产量极其显著的同步下降。为此，本实验以水稻高亲和转运蛋白基因OsHAK1为研究对象，通过研究突变体oshak1与野生型形态的差异、内源生长素含量、[3H]-IAA运输以及PIN家族的基因表达来阐明OsHAK1影响水稻形态的机理;通过比较突变体oshak1与野生型花器官形态与花粉萌发的不同来研究OsHAK1对水稻育性的影响;通过对15N的示踪以和水稻体内NO3-的含量来分析比较OsHAK1与OsHAK5对水稻NO3-吸收和体内运输的影响。具体研究结果终结如下:
　　1、通过正常K(1mM)与缺K(0.1 mM)条件下水稻根系形态的研究，我们发现0.1 mM培养条件下，在苗龄为10天的水稻幼苗中，突变体oshak1根毛长度比野生型降低了40％，侧根密度与侧根长度也降低20％左右，而侧根生长区的K+含量并没有与野生型表现出显著差异，说明OsHAK1敲除造成的根系形态改变并不仅仅是由于根系K+的吸收和运输受到抑制所导致的。
　　2、许多研究表明，植物的根系形态受生长素极性运输的调控。我们对7天苗龄的突变体oshak1与野生型根尖生长素流速的检测发现，敲除OsHAK1后制了生长素的跨细胞运输，而超表达OsHAK1则可以促进根尖表皮的生长素跨细胞运输，敲除OsHAK1也改变了水稻根系中OsPIN1与OsPIN2的表达。通过根尖施加[3H]-IAA发现，5个小时后突变体oshak1根系1-3 mm、3-5 mm，5-7 mm，7-9 mm，9-11 mm处的[3H]-IAA浓度均比野生型低50％以上，说明生长素向上运输受阻。而在根基施加外源生长素，8小时内突变体oshak1根部[3H]-IAA含量与野生型并没有明显差异，只是在18小时后，突变体oshak1根系[3H]-IAA含量高于野生型60％。这一结果进一步说明OsHAK1的敲除抑制了生长素从根尖向根基部的极性运输，而对生长素从根基向根尖的极性运输并没有显著抑制。
　　3、胞间pH影响生长素的极性运输，低pH可以促进IAA质子化从而直接渗透进入细胞。我们通过调控培养基pH检测OsHAK1基因对水稻根系向地性以及根尖生长素流速实验发现，低pH条件下敲除OsHAK1减弱了水稻根系的向地性，生长素在根系中的流动也受到抑制。说明了OsHAK1可能通过调节水稻根系的pH稳态平衡，从而影响生长素的吸收转运。
　　4、通过对开花期水稻花器官的观察，我们发现敲除OsHAK1导致水稻花器官发育迟缓、花药畸形变短、雌蕊柱头变短变小。我们利用扫描电镜扫描花粉粒发现突变体oshak1花粉粒发育不完全、花粉内淀粉等内容物减少，并且突变体oshak1瘪壳状花粉粒多于野生型，花粉粒活性降低了50％左右。结果证明OsHAK1在花粉发育过程中起着重要作用。另外我们通过花粉的体外、体内萌发实验发现敲除OsHAK1抑制了花粉的蒴发率以及花粉管的长度，表明OsHAK1对花粉管的萌发和伸长有突出贡献。另外基因敲除导致柱头羽状突出变小，柱头上黏附的花粉明显小于野生型。我们的正反杂交试验结果也展示OsHAK1同时影响水稻雌、雄器官的育性。
　　5、通过对OsHAK1对NO3的吸收分析发现，在低钾(0.3 mM)条件下，突变体oshak1水稻的15N-NO3-吸收速率显著降低，说明OsHAK1是低K条件下水稻吸收NO3-的限制因素之一。我们对突变体oshak1、超表达与野生型材料24小时内15N-NO3-转运、植株以及伤流液中NO3-含量的分析发现，在低K情况下，突变体oshak1根系中NO3-向地上部的转运变少，同时超表达OsHAK1可以促进低钾(0.3 mM)条件下水稻地下部NO3-向地上部的转运。
　　6、OsHAK5是水稻HAK家族中与OsHAK1同亚族的基因成员，相较其它成员，这两个基因有着最高的同源性。OsHAK5在低K条件下对水稻根系K+的吸收以及向地上部转运有重要贡献。我们通过突变体oshak5、超表达与野生型材料对NO3-的吸收分析发现，低K条件下超表达OsHAK5可以促进水稻对NO3-的吸收以及向地上部的转运。在24小时内15N-NO3-的转运实验以及植株NO3-含量的分析中我们发现，在低K(0.3mM)培养条件下，OsHAK5影响NO3-向叶片的转运。
　　综上所述，OsHAK1作为K+转运蛋白，对水稻根部生长素极性运输（根尖到根基）起重要作用，对水稻花粉的发育与萌发有显著影响。另外OsHAK1与OsHAK5对水稻体内NO3-的吸收以及水稻体内NO3-与K+的穿梭运输均有一定影响，但两者之间仍呈现显著差异。本研究表明，通过分子遗传改良，选择性改变钾离子转运蛋白基因的表达可以调控禾本科作物的根系生长发育、株型及其育性，促进氮钾平衡，有助于挖掘高产与养分高效协同的潜力。

目录

论文说明

声明

摘要

英文缩略符及其中英文对照表

第一章 文献综述

1．1 引言

1．2 钾离子在植物中的生理功能

1．2．1 加强酶的活性

1．2．2 促进蛋白的合成

1．2．3 维持细胞电荷平衡和渗透调节

1．2．4 调节气孔运动

1．2．5 增强光合作用

1．2．6 促进韧皮部的养分运输

1．3 植物对钾离子的吸收和运输

1．3．1 钾离子吸收的双相动力学特征

1．3．2 钾离子通道

1．3．3 钾离子转运蛋白

1．4 植物钾离子转运蛋白对植株生长发育的影响

1．4．1 钾离子转运蛋白对根系和株形发育的影响

1．4．2 钾离子转运蛋白对植物开花结实的影响

1．5．生长素对植物形态发育的影响

1．5．1 生长素决定植株的形态特征

1．5．2 生长素在植物体内的运输

1．5．3 胞间pH对生长素跨膜运输的影响

1．5．4 HAK钾转运蛋白活性与胞间pH对生长素极性运输的影响

1．6 钾离子对植物氮素吸收、运输和利用的影响

1．6．1 钾离子对铵根离子吸收和利用的影响

1．6．2 钾离子对硝酸根离子吸收和运输的影响

第二章 研究目的、意义和技术路线

2．3 技术路线

第三章 钾转运蛋白OsHAK1对水稻生长发育的调控

3．1 引言

3．2 材料与方法

3．2．4 半薄切片方法

3．2．5 qRT-PCR分析相关基因表达

3．2．6 水稻根尖IAA生长素流速测定

3．2．7 生长素的提取与测定

3．2．8 [3H]IAA极性运输

3．2．9 pH对根向地性的影响

3．2．10 数据处理

3．3 结果与分析

3．3．2 OsHAK1对水稻根系形态的影响

3．3．3 OsHAK1对水稻根系不同部位K离子浓度的影响

3．3．4 OsHAK1对水稻地上部的影响

3．3．5 OsHAK1对水稻编码生长素转运蛋白基因表达的影响

3．3．6 OsHAK1对水稻根尖生长素流速的影响

3．3．7 外源施加生长素对生长素极性运输的影响

3．3．8 OsHAK1对根尖和根基生长素含量的影响

3．3．9 介质pH对OsHAK1突变体根尖生长素流速的影响

3．3．10 介质pH对OsHAK1突变体与超表达材料向地性的影响

3．4 讨论

第四章 钾转运蛋白OsHAK1对水稻花粉育性的影响

4．1 引言

4．2 材料与方法

4．2．1 实验材料

4．2．2 田间种植

4．3．1 OsHAK1对花穗发育的影响

4．3．2 OsHAK1对花粉粒发育的影响

4．3．3 OsHAK1对花粉粒育性的影响

4．4 讨论

第五章 钾转运体OsHAK1、OsHAK5对硝酸根吸收和转运的影响

5．1 引言

5．2 材料与方法

5．2．1 试验材料

5．2．2 水稻体内氮素积累的测定

5．2．3 15N-NO3-吸收和转运实验

5．2．4 基因表达分析

5．3 结果与分析

5．3．1 OsHAK1、OsHAK5对水稻根系15N-NO3-吸收速率的影响

5．3．2 OsHAK1、OsHAK5对水稻体内15N-NO3-转运的影响

5．3．3 OsHAK1、OsHAK5对水稻硝态氮积累的影响

5．4 讨论

5．4．1 OsHAK1、OsHAK5对水稻硝酸盐吸收的影响

5．4．2 OsHAK1对水稻硝酸盐运输的影响

5．4．3 OsHAK5对水稻硝酸盐运输的影响

全文结论

创新点

参考文献

附录

在读期间发表论文

致谢