猪丹毒杆菌噬菌体分离、鉴定及应用研究

摘要

猪丹毒(Swine Erysipelas)也叫钻石皮肤病(diamond skin disease)或红热病(red fever)，是由红斑丹毒丝菌（Erysipelothrix rhusiopathiae）引起的一种急性、热性传染病。近年来猪丹毒发病趋势愈演愈烈，各地不时有猪丹毒发生的报道，给养猪业造成了重大的经济损失。目前在养猪生产中，控制猪丹毒杆菌的方法主要有两种:一是通过接种疫苗，二是药物治疗。而在此前的报道中表明猪丹毒杆菌对大对数抗生素具有耐药性，一旦抗生素对该菌失去杀灭作用，势必会造成猪丹毒的再次大规模爆发。噬菌体(Bacteriophage)是一种细菌病毒，可吸附到宿主细菌表面，在其体内生长繁殖，并最终使细菌裂解，以此可起到特异性杀灭宿主细菌的作用。我们通过对猪丹毒杆菌噬菌体进行分离、纯化及其宿主谱的研究，表明该噬菌体可特异性杀灭猪丹毒杆菌，并对其在小鼠体内的杀菌情况做了一系列研究。通过对其基因组分析得到该噬菌体裂解细菌的关键性蛋白-裂解酶，并对其裂菌条件做了一系列的优化，具体研究内容分为以下3个部分:
　　1.猪丹毒杆菌噬菌体分离、鉴定
　　2014年8月，江苏省盐城市一家猪场-上海农场爆发猪丹毒，经过剖检病死猪发现其心、肝、肾、脾均呈典型的败血症变化。从发病猪猪舍周围的环境中采取泥土、粪便并分离获得猪丹毒杆菌噬菌体，我们将其命名为SE-1。经过连续5次单斑纯化后，扩增培养该噬菌体并通过电镜观察该噬菌体形态。SE-1头部为正二十面体的长尾噬菌体。提取该噬菌体基因组进行高通量测序，SE-1基因组大小为34997bp，GC含量为34％，包含43个开放阅读框（表达噬菌体的包装蛋白、结构蛋白、裂解酶-穿孔素蛋白以及假设蛋白）。通过蔗糖密度梯庋离心纯化噬菌体颗粒，并通过液相色谱与质谱联用分析SE-1的结构蛋白成分，鉴定出ORF9、ORF15、ORF23、ORF30、ORF31、ORF33、ORF39、ORF40和ORF42等九个蛋白。应用终止酶大亚基序列构建系统进化树来分析SE-1同源性，表明该噬菌体与葡萄球菌噬菌体P954和phi3396同源性较高。通过蚀斑实验表明SE-1可感染13株实验室保存的猪丹毒杆菌中的7株，但是不能感染沙门氏菌、链球菌和葡萄球菌。这是首例关于猪丹毒杆菌噬菌体特性、基因组和蛋白组的报道，该研究的成功开展将有助于开发一种抗猪丹毒杆菌的新药物。
　　2.噬菌体动物体内的治疗实验
　　由于噬菌体具有高度的宿主特异性，有别于抗生素会影响正常菌群。因此，近年来，噬菌体用于治疗人和动物细菌性疾病方面的潜在价值受到广泛的关注。在之前的研究工作中，我们实验室成功分离出猪丹毒杆菌噬菌体，并将其命名为SE-1。本实验为了研究猪丹毒杆菌噬菌体在体内是否具有杀菌功能，我们统计出猪丹毒杆菌的半数致死量并且对注射部位、注射时间、注射剂量等对噬菌体SE-1用于治疗的条件进行优化，通过菌落计数观察小鼠血液中猪丹毒杆菌的变化检测噬菌体SE-1在小鼠体内的杀菌作用。实验证明，在优化条件后，同未注射噬菌体的阴性对照组相比，实验组小鼠在注射噬菌体72h后，小鼠体内细菌数量减少10倍左右，证明了猪丹毒杆菌噬菌体在小鼠体内具有杀菌的功能。为后续开发治疗猪丹毒杆菌感染的新药物开辟一条新道路。
　　3.猪丹毒杆菌噬菌体裂解酶的表达及应用研究
　　噬菌体裂解酶是在噬菌体DNA感染细菌后期表达的一种蛋白，可高效水解细菌细胞壁以释放子代噬菌体，在体外可特异性的杀死细菌。本实验的目的旨在克隆和表达猪丹毒杆菌噬菌体裂解酶Ely并检测其是否具有生物学活性。通过对猪丹毒杆菌噬菌体基因纽进行测序及生物学分析后发现SE-1表达裂解酶，对该噬菌体裂解酶基因进行PCR扩增，构建表达载体pET-28a(+)-Ely，并转化到大肠杆菌B121(Rosetta)中，以1mmol/l IPTG在28℃诱导8h，通过SDS-PAGE鉴定蛋白高效表达在上清中，通过Ni2+-NTA亲和层析法纯化目的蛋白，其纯度在90％以上，以100μg/ml,10μg/ml，1μg/ml的终浓度作用于猪丹毒杆菌，并每隔1h收集样品进行菌落计数，直到7h，设未加入裂解酶的阴性对照。并且从作用温度、作用pH、最佳作用离子三个方面对裂解酶的裂解条件进行优化。为治疗耐药性猪丹毒杆菌开辟了一条新的思路。

目录

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摘要

第一章 文献综述

1 红斑丹毒丝菌与猪丹毒概述

1．1 红斑丹毒丝菌

1．2 猪丹毒

2 猪丹毒杆菌的防控

2．1 药物治疗

2．2 疫苗预防

2．3 环境控制

3 噬菌体

3．1 噬菌体概述

3．2 噬菌体的发现历史

3．3 噬菌体分类

3．4 噬菌体宿主谱的确定

3．5 噬菌体与细菌共同进化史

3．6 噬菌体治疗：抗生素耐药性的潜在解决方案

3．7 噬菌体未来发展的前景

4 噬菌体裂解酶

4．1 裂解酶概述

4．2 裂解酶的应用

4．3 裂解酶可能存在的问题及研究现状

参考文献

第二章 猪丹毒杆菌噬茵体分离、鉴定

1 材料和方法

1．1 材料

1．2 细菌分离与鉴定

1．3 噬菌体分离与纯化

1．4 噬菌体扩增及效价测定

1．5 噬菌体宿主谱

1．6 电镜观察噬菌体形态

1．7 噬菌体基因组提取、纯化及酶切分析

1．8 高通量测序及分析

1．9 液相色谱与质谱联用分析噬菌体主要蛋白

2 结果

2．1 细菌培养特性和形态特征

2．2 猪丹毒杆菌噬菌体分离与纯化结果

2．3 猪丹毒杆菌噬菌体扩增-最佳扩增MOI结果

2．4 猪丹毒杆菌噬菌体宿主谱结果

2．5 电镜观察结果

2．6 猪丹毒杆菌噬菌体基因组纯化及酶切分析结果

2．7 高通量测序及基因注释结果

2．8 噬菌体颗粒纯化及质谱分析结果

2．9 噬菌体同源性分析结果

3 讨论

参考文献

第三章 噬菌体治疗小鼠感染研究

1 材料

1．1 六周龄ICR小鼠半数致死量(LD50)测定

1．5 菌血症动态变化-菌落计数

1．6 噬菌体在小鼠体内分布检测

2 结果

2．1 六周龄ICR小鼠半数致死量结果

2．2 噬菌体治疗条件的优化

2．3 菌血症动态变化-菌落计数结果

2．4 猪丹毒杆菌噬菌体在小鼠体内的分布结果

3 讨论

参考文献

第四章 猪丹毒杆菌噬菌体裂解酶作用条件优化

1 材料和方法

1．1 材料

1．2 猪丹毒杆菌噬菌体裂解酶同源性分析

1．3 重组质粒的构建与鉴定

1．4 重组蛋白的表达

1．5 重组蛋白表达的鉴定

1．6 裂解酶Ely裂解活性评价

1．9 裂解酶蛋白裂菌条件优化-最适离子筛选

2 结果

2．1 基于裂解酶蛋白Ely同源性分析

2．2 裂解酶基因的克隆和重组质粒pET-28a(+)-Ely的构建与鉴定

2．3 重组蛋白的原核表达及Western blot鉴定

2．4 裂解酶蛋白裂解细菌活性验证及其与剂量的关系

2．5 裂解酶最佳作用温度筛选结果

2．6 裂解酶最佳作用pH筛选结果

2．7 裂解酶蛋白裂菌条件优化-最适离子筛选

3 讨论

参考文献

全文总结

致谢