三种不同品系红罗非鱼耐寒性能比较以及体色相关基因表达分析

摘要

体色是鱼类一种较独特的表型性状，有重要的生物多样性价值和遗传学理论研究价值。鱼类体色变化是一个复杂的过程，遗传因素以及水温、光照、pH值、溶氧等众多外界环境因素都会造成鱼类体色的变化。在红罗非越冬养殖期间发现，经历过低温的红罗非鱼通常会发生体色变化，出现红色或者黑色斑纹，这样的变化会使红罗非鱼的经济价值下降。红罗非鱼是暖水性鱼类，具有不耐低温的特性。推断低温会影响红罗非鱼体色变化。本文从血清生理生化指标、抗氧化酶及两个抗寒候选基因角度分析比较了以色列、台湾和马来西亚三个红罗非鱼品系的耐寒性差异。为了进一步深入探讨红罗非鱼体色变化的机制，从黑色素合成通路的分子角度比较了6个体色相关基因(MC1R、TYRP1、ASIP、DCT、SOX10和S1C7A11)在三个红罗非鱼品系中的表达差异。主要研究结果如下:
　　1.三个不同品系红罗非鱼耐寒性能比较
　　实验选取平均体重为500g左右的以色列品系、台湾品系和马来西亚品系的红罗非鱼作为实验对象，设定19℃的常温对照组和从19℃开始每天降低1℃直到8℃的冷应激实验组，每组设定2个平行组，每个平行组中6尾鱼。对照组在实验开始时进行采样，实验组在鱼开始出现死亡情况时进行采样。测定血清丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)、血糖(GLU)、总蛋白(TP)、K+、Na+、C1-、总超氧化物歧化酶、丙二醛和超微量Na+-K+-ATP酶。结果表明:以色列和台湾品系在10.3℃开始出现死亡个体，马来西亚品系的耐寒性能更强一点，在9.3℃出现死亡个体。三个品系红罗非鱼在8.3℃全部死亡。罗非鱼可在6-10℃低温下短暂存活，但是无法存活24h以上。以色列和台湾品系死亡温度比马来西亚品系高1℃。与对照组相比，三个品系的实验组ALT、AST、LDH、GLU含量显著上升(P＜0.05)，以色列和台湾品系TP含量显著性下降(P＜0.05)，而马来西亚品系TP含量显著上升(P＜0.05)。以色列品系SOD含量显著上升(P＜0.05)，MDA含量显著上升(P＜0.05), Na+-K+-ATP酶含量显著下降(P＜0.05);台湾品系和马来西亚品系SOD含量显著下降(P＜0.05)，Na+-K+-ATP酶含量显著上升(P＜0.05)。三种品系的耐寒性能不同，所以体内的抗氧化酶含量以及活性也并不相同，其中马来西亚品系经历的温度更低，鱼体内脏等受损程度更加严重，所以体内抗氧化酶等不能发挥其免疫的作用，而是三种品系抗氧化酶等活性表达量不同。当受到低温胁迫时，SCD基因在以色列品系、台湾品系肝脏中mRNA表达量显著上升，SCD基因在马来西亚品系肝脏中mRNA表达量显著下降(P＜0.05)。HSP70基因在以色列品系、台湾品系和马来西亚品系肝脏中mRNA表达量显著上升(P＜0.05)。可见，急性低温应激可以引起红罗非鱼体的生理机能的变化，其中马来西亚品系红罗非的耐寒性比以色列和台湾品系红罗非耐寒性能可能更强。
　　2、以色列、台湾、马来西亚品系红罗非体色相关基因的表达分析
　　(1)马来西亚红罗非6个体色相关基因的表达分析
　　实验材料选择身体健壮，健康状况良好的马来西亚红罗非“红斑”、“粉白”、“黑斑”三种体色类型的各3尾。每尾鱼采集背部皮肤、腹部皮肤、肌肉、肠、心、脑共六种组织。qRT-PCR分析表明，MC1R、ASIP、TYRP1、DCT和SLC7A11基因在皮肤组织中表达量显著高于其他四个组织中的表达量(P＜0.05)，在心脏和肠中表达量次之，在肌肉和脑中表达量最低;SOX10基因在脑中表达量显著高于其他四个组织(P＜0.05)，在皮肤及肌肉中表达量次之，在肠和心中表达量最低。MC1R、ASIP、TYRP1、SOX10和SLC7A11基因在红斑体色类型皮肤中的表达量显著地高于其他体色(P＜0.05)。DCT基因在粉白体色类型和黑斑体色类型的皮肤组织中表达量显著的高于红斑体色类型(P＜0.05)。由此可以得知体色类型并不是由一个基因控制的，是由一个复杂的基因网络进行调控，各基因之间相互作用最终决定与体色类型。
　　(2)三个品系红罗非皮肤组织中6个基因的表达差异分析
　　实验材料选择身体健壮，健康状况良好的红罗非鱼。马来西亚、台湾和以色列品系各取3尾的背部和腹部皮肤组织。对这三种红罗非品系的背部和腹部皮肤组织进行了基因mRNA的表达差异比较。qRT-PCR分析表明，在背部皮肤组织中，MC1R、ASIP、TYRP1、DCT、SOX10和SLC7A11基因在马来西亚品系表达量显著的高于其他两个品系(P＜0.05)，ASIP和TYRP1基因在以色列品系中的表达量显著的高于台湾品系中的表达量(P＜0.05)，MC1R、DCT、SOX10和SLC7A11基因在以色列和台湾品系中的表达量没有显著性差异(P＞0.05)。在腹部皮肤组织中，MC1R、ASIP、DCT和SOX10基因在马来西亚品系表达量最高，TYRP1和SLC7A11基因在台湾品系中表达量最高。TYRP1和SLC7A11基因在以色列、台湾与马来西亚品系中均有显著性差异(P＜0.05)，MC1R、ASIP和SOX10基因在以色列与台湾品系中均存在显著性差异(P＜0.05)。由此可以得知体色相关基因的表达量与鱼种类有一定的相关性。
　　(3)6个基因在各品系红罗非鱼背腹部皮肤组织中表达差异
　　马来西亚、台湾和以色列品系各取3尾的背部和腹部皮肤组织。对每种品系红罗非品系的背部和腹部皮肤组织中的6个基因mRNA的表达差异进行比较。qRT-PCR分析表明，在以色列品系中，MC1R、TYRP1、DCT、SOX10和SLC7A11基因在背部皮肤组织的表达量显著的高于腹部皮肤(P＜0.05);在台湾品系中，ASIP基因在腹部皮肤组织中表达量显著的高于背部皮肤(P＜0.05)，MC1R、DCT、SOX10和SLC7A11基因在背部的表达量显著高于腹部皮肤(P＜0.05)。在马来西亚品系中，MC1R、ASIP、TYRP1、SOX10和SLC7A11基因在背部的表达量显著高于腹部皮肤(P＜0.05)。由此可以得知，ASIP基因在红罗非鱼的背部和腹部皮肤组织表达有差异。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1 鱼类耐寒性研究进展

1．1 鱼类耐寒性能研究现状

1．2 低温对鱼类生理造成的影响

2 耐寒相关基因研究进展

2．1 热休克蛋白70的研究进展

2．2 SCD基因的研究进展

3 色素细胞

3．1 黑色素细胞

3．2 黑色素的合成

4 黑色素合成通路基因

4．1 MC1R基因

4．2 ASIP基因

4．3 TYRP1基因

4．4 DCT基因

4．6 SLC7A11基因

5 实时荧光定量PCR技术

5．1 荧光定量PCR技术的概念及测定方法

5．2 荧光定量PCR技术的优点及实际应用

6 本实验研究的目的、意义

7 研究内容

第二章 三个品系红罗非耐寒性实验

2．1 实验材料

2．2 实验仪器

2．3 实验设计

2．4 血清样品的制备

2．5 血清生化指标的测定

2．6 肝脏和鳃抗氧化酶的测定

2．7 组织RNA提取

2．8 RNA反转录反应

2．9 引物的设计合成

2．10 数据处理

3．2 血清生化指标的变化

3．3 抗氧化酶的变化

3．4 抗寒基因的表达的差异

4 分析

4．1 血清生化指标

4．2 抗氧化酶

4．3 抗寒基因

第三章 以色列、台湾、马来西亚品系红罗非体色相关基因的表达分析

2．1 实验材料

2．2 主要仪器

2．3 实验试剂

2．4 实验方法

3 实验结果

3．1 体色相关基因在马来西亚(粉白色)品系各组织分布差异

3．2 马来西亚品系不同体色间差异

3．3 体色相关基因在背部皮肤和腹部皮肤组织表达情况

3．4 体色相关基因在背腹部皮肤组织差异性表达

4 讨论

4．1 体色相关基因在马来西亚品系不同组织中的表达情况

4．2 体色相关基因在马来西亚品系三种体色中的表达情况

4．3 6个基因在三种不同品系中皮肤表达量

4．4 红罗非鱼三个品系不同部位皮肤表达

全文总结

参考文献

科研情况

致谢