固相载锌凹凸棒石黏土对肉鸡锌生物利用率及免疫调节机制的研究

摘要

锌是动物必需的微量元素之一，具有广泛的生理功能，且具有抗菌作用。利用硅铝酸盐矿物负载锌离子制成的无机抗菌剂抗菌作用强，但其应用于饲料中是否能作为锌源补充剂和抗生素替代品则鲜见报道。因此，本研究以凹凸棒石黏土和氯化锌为原料，优化确定固相熔盐离子交换法制备载锌凹凸棒石黏土(Zinc-bearing Palygorskite，Zn-Pal)的最适条件;通过体外法研究Zn-Pal中主要金属元素释放规律及Zn-Pal的抗菌作用，并对载锌前后及体外消化后的Zn-Pal进行表征分析。通过肉鸡试验，研究Zn-Pal锌的生物利用率，以及其同时作为锌源和抗生素类促生长剂替代品对肉鸡生产性能、免疫机能和肠道菌群的影响，以期为新型载锌凹土在肉鸡饲料中合理应用提供理论依据。本研究分为以下六部分:
　　试验一:固相熔盐离子交换法制备Zn-Pal最适条件的优化确定，并对载锌前后凹土样品采用DEXRF、XRD、FTIR进行结构分析，测定比表面积和Zeta电位，同时采用SEM和TEM观察结构特征。结果表明，原料质量比、反应温度和反应时间均显著影响锌负载量（P＜0.05），影响程度依次为:温度＞时间＞原料质量比。固相法制备Zn-Pal的最适条件为:凹土与ZnCl2质量比4∶1，反应温度为300℃，反应时间为3.0h。结构分析显示，锌负载过程不影响凹土晶体结构。负载锌后凹土比表面积下降，Zeta电位提高。
　　试验二:体外法模拟肉鸡嗉囊、肌胃和小肠pH环境研究Zn-Pal主要金属元素的释放规律，并对在每个pH条件处理结束的Zn-Pal进行结构分析。结果表明，在pH5.0时，Zn-Pal中负载的锌快速释放，pH2.5时锌释放量有所下降，在pH6.0时释放量最少，体外解吸率为68.22％～71.79％。 Zn-Pal中的Mg、 Al、Fe可少量释放，其中Mg的释放量最大。在pH2.5时，Mg、 Al、Fe释放量最大。结构分析显示，Zn-Pal中金属元素释放不影响凹土晶体结构。Zn-Pal经不同pH条件处理后比表面积增大，Zeta电位降低。
　　试验三:研究Zn-Pal对肉鸡大肠杆菌的抗菌作用及对脂多糖(LPS)的吸附效果。结果显示，Zn-Pal对肉鸡大肠杆菌具有良好的抗菌作用，且具有剂量效应。Zn-Pal对肉鸡大肠杆菌的MIC和MBC分别为17.5 mg/mL和40 mg/mL，相应的锌离子浓度分别为0.83 mg/mL和1.89 mg/mL。4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色结果显示，经Zn-Pal作用2h后，菌液DNA、RNA荧光强度显著降低，且随Zn-Pal添加量增加显著降低（P＜0.05）。Zn-Pal显著降低菌液中LPS含量（P＜0.05），亦具有剂量效应。
　　试验四:评价Zn-Pal对肉鸡锌的生物利用率，探讨Zn-Pal作为锌源补充剂的可行性。432只1日龄AA肉鸡随机分为9组，每组6个重复，每个重复8只试验鸡，分别饲喂玉米-豆粕型基础日粮（外源锌添加量0 mg/kg）、基础日粮+Zn-Pal（锌添加水平为20、40、60、80 mg/kg）、基础日粮+饲料级ZnSO4(锌添加水平为20、40、60、80 mg/kg)。结果显示，添加锌源和锌水平对生产性能均无显著影响(P＞0.05)。锌添加水平显著影响21d和42 d肉鸡胰腺、胫骨及胸肌锌含量(P＜0.01)，具有剂量效应。在21 d，Zn-Pal组全血锌含量显著高于ZnSO4组（P＜0.01）;与基础日粮组相比，Zn-Pal-40、Zn-Pal-60和Zn-Pal-80组肉鸡全血锌含量显著提高(P＜0.05)。在42 d，Zn-Pal-60组和ZnSO4-80组肉鸡组织锌含量最高，且两处理组差异不显著（P＞0.05）。分别以胰腺、胫骨和胸肌锌含量为考察指标，ZnSO4为对照，Zn-Pal对21 d肉鸡锌的生物利用率分别为109.64％，100％，100％。分别以胰腺和胫骨锌含量为考察指标，ZnSO4为对照，Zn-Pal对42 d肉鸡锌的生物利用率分别为86.32％和119.5％。
　　试验五:将Zn-Pal同时作为锌源和抗生素类促生长剂替代品，研究其对肉仔鸡生产性能和免疫机能的影响。336只AA肉鸡随机分为7组，每组6个重复，每个重复8只试验鸡，分别饲喂玉米-豆粕型基础日粮（对照组，不补充锌且无抗生素类促生长剂）、基础日粮+1.28 g/kg活化凹土（活化凹土组，PAL）、基础日粮+ZnSO4(ZnSO4组，锌添加水平60 mg/kg)、基础日粮+ZnSO4+40 mg/kg金霉素（常规日粮组，锌添加水平60 mg/kg）、基础日粮+0.43 g/kg Zn-Pal（Zn-Pal-20组，锌添加水平20 mg/kg）、基础日粮+0.85 g/kg Zn-Pal（Zn-Pal-40组，锌添加水平40 mg/kg）、基础日粮+1.28 g/kgZn-Pal（Zn-Pal-60组，锌添加水平60 mg/kg）。结果表明，与对照组相比，常规日粮组及Zn-Pal组肉鸡ABW和ADG显著提高(P＜0.05)，Zn-Pal-40组肉鸡脾脏指数显著提高(P＜0.05)。各Zn-Pal组肉鸡法氏囊指数显著高于对照组（P＜0.05），与常规日粮组无显著差异（P＞0.05）。对照组肉鸡血清IL-6含量显著低于其他试验组（P＜0.05）。Zn-Pal-40和Zn-Pal-60组肉鸡血清C3含量显著高于对照组（P＜0.05），与常规日粮组无显著差异（P＞0.05）。与对照组相比，ZnSO4组、常规日粮组、Zn-Pal-40和Zn-Pal-60组肉鸡血清C4含量显著提高（P＜0.05）。常规日粮组和Zn-Pal组肉鸡血清溶菌酶活性显著高于对照组(P＜0.05)。Zn-Pal-40和Zn-Pal-60组肉鸡十二指肠黏膜IgG含量显著高于对照组（P＜0.05），与常规日粮组无显著差异(P＞0.05)。对照组肉鸡回肠黏膜IgG含量显著低于其他各试验组(P＜0.05)。Zn-Pal组和ZnSO4组肉鸡十二指肠sIgA分泌细胞阳性表达面积显著高于对照组和PAL组（P＜0.05），与常规日粮组无显著差异（P＞0.05）。对照组肉鸡回肠黏膜Toll-NF-κB信号传导通路中相关基因mRNA表达量显著高于其他试验组（P＜0.05）。
　　试验六:通过平板计数法和对高通量测序技术研究Zn-Pal对肉鸡盲肠微生物区系的影响。336只AA肉鸡随机分为7组，每组6个重复，每个重复8只试验鸡，分别饲喂玉米-豆粕型基础日粮（对照组，不补充锌且无抗生素促生长剂）、基础日粮+1.28g/kg活化凹土（活化凹土组，PAL）、基础日粮+ZnSO4(ZnSO4组，锌添加水平60 mg/kg)、基础日粮+ ZnSO4+40 mg/kg金霉素（常规日粮组，锌添加水平60 mg/kg）、基础日粮+0.43 g/kg Zn-Pal（Zn-Pal-20组，锌添加水平20 mg/kg）、基础日粮+0.85 g/kg Zn-Pal（Zn-Pal-40组，锌添加水平40 mg/kg）、基础日粮+1.28 g/kg Zn-Pal（Zn-Pal-60组，锌添加水平60 mg/kg）。结果显示，常规日粮组大肠杆菌、沙门氏菌菌和乳酸杆菌落数比对照组分别减少6.00％、1.14％和4.54％(P＞0.05)。Zn-Pal-40组大肠杆菌、沙门氏菌菌落数比对照组相分别减少5.75％和3.27％，乳酸杆菌菌落数提高4.04％（P＞0.05）。基于细菌门和纲分类学水平分析，基础日粮中添加锌水平为20～60 mg/kg的Zn-Pal对肉鸡盲肠微生物丰度及多样性无显著影响。基于细菌属水平分析，与Zn-Pal-60组相比，对照组、PAL组、ZnSO4组、常规日粮组、Zn-Pal-20和Zn-Pal-40组乳酸菌属相对丰度分别降低58.49％、23.13％、19.71％、71.73％、24.48％和9.43％(P＞0.05)。
　　综上所述，在本试验条件下，得出以下结论:
　　(1)固相法制备载锌凹土的最适条件是:凹土与ZnCl2质量比4∶1、反应温度为300℃、反应时间为3.0 h;工艺条件对锌负载量的影响程度排序为:温度＞时间＞凹土与ZnCl2质量比;锌负载过程不影响凹土晶体结构。
　　(2)固相载锌凹土中锌在体外模拟消化道pH环境中解吸率为68.22％～71.79％;低pH条件有利于凹土中的镁、铝、铁等金属元素释放;金属元素释放不影响凹土晶体结构。
　　(3)固相载锌凹土通过其负载的锌离子对肉鸡大肠杆菌发挥抗菌作用，并通过影响其表面电荷吸附大肠杆菌产生的LPS，对肉鸡大肠杆菌MIC和MBC分别为17.5mg/mL和40 mg/mL，相应的锌离子浓度分别为0.83 mg/mL和1.89 mg/mL。
　　(4)以ZnSO4为对照，胫骨锌含量为指标，固相载锌凹土对21d和42 d肉鸡锌生物利用率分别为100％和119.55％;1～42 d肉鸡日粮中固相载锌凹土最适添加量为60 mg/kg锌水平。
　　(5) Zn-Pal可同时作为锌源补充剂和抗生素类促生长剂替代品应用于饲料中，提高了肉鸡生长性能和免疫机能，在1～21 d肉仔鸡日粮中最适添加量为40～60 mg/kg锌水平。
　　(6)固相载锌凹土调节肉仔鸡免疫机能的可能机制是:改善肠道黏膜免疫机能，通过TLRs-NF-κB信号传导通路调节免疫机能，并保持盲肠微生态平衡。

目录

声明

摘要

主要缩略词中英文对照

引言

第一章 肉鸡饲料中锌源添加剂的生物利用率研究进展

1．1 无机锌

1．2 有机锌

1．3 生物转化锌

1．4 天然载体富集锌

2 锌生物利用率的研究方法

2．1 平衡试验法

2．2 参比法

第二章 锌对机体免疫功能的影响

1 锌对免疫器官的影响

2 锌对非特异性免疫应答的影响

3 锌对特异性免疫应答的影响

3．1 锌对细胞免疫应答的影响

3．2 锌对体液免疫应答的影响

第三章 锌的抗菌性能和载锌硅铝酸盐矿物材料研究进展

1 锌的抗菌性能

2 饲料中常用硅铝酸盐矿物材料的特性及其应用研究

2．1 凹土、沸石及蒙脱石特性及其差异分析比较

2．2 凹土、沸石、蒙脱石及其改性产品在肉鸡养殖中的应用研究

3 载锌硅铝酸盐矿物材料制备方法

3．1 液相离子交换法

3．2 固相熔盐离子交换法

4．1 载锌硅铝酸盐矿物材料抗菌性能研究

4．2 载锌硅铝酸盐矿物材料在其它行业中的应用研究

5 载锌硅铝酸盐矿物材料在饮料中的应用研究

5．1 抗生素类促生长剂替代品、抗腹泻肠道保护剂

5．2 霉菌毒素吸附剂

5．3 锌源补充剂

6 应用研究展望

第四章 固相载锌凹凸棒石黏土的制备条件及其特性研究

1．1 试验材料

1．2 试验设计

1．3 数据统计与分析

2 结果与分析

2．1 单一因素试验

2．2 正交试验

2．3 凹土和固相载锌凹土主要化学成分分析

2．4 XRD图谱分析

2．5 FTIR图谱分析

2．6 凹土和固相载锌凹土比表面积分析

2．7 凹土和固相载锌凹土Zeta电位分析

2．8 凹土和固相载锌凹土扫描电镜(SEM)分析

2．9 凹土和固相载锌凹土透射电镜(TEM)分析

3 讨论

3．1 固相熔盐离子交换法制备载锌凹土的条件研究

3．2 固相载锌凹土载锌前后化学组成及表征分析

4 小结

第五章 固相载锌凹凸棒石黏土中金属元素体外释放规律研究

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 试验设计与方法

1．3 数据统计与分析

2 结果与分析

2．1 固相载锌凹土中负载的锌体外释放规律研究

2．2 凹土和固相载锌凹土中镁的体外释放规律研究

2．3 凹土和固相载锌凹土中铝的体外释放规律研究

2．4 凹土和固相载锌凹土中铁的体外释放规律研究

2．5 缓冲液中钠的浓度变化

2．6 不同pH条件下处理固相载锌凹土前后的化学组成

2．7 不同pH条件下处理固相载锌凹土前后的XRD图谱分析

2．8 不同pH条件下处理固相载锌凹土前后FTIR图谱分析

2．9 不同pH条件下处理固相载锌凹土前后比表面积分析

2．10 不同pH条件下处理固相载锌凹土前后Zeta电位分析

2．11 不同pH条件下处理固相载锌凹土前后透射电镜(TEM)分析

3 讨论

3．1 固相载锌凹土中负载的锌体外释放研究

3．2 固相载锌凹土主要金属元素体外释放研究

3．3 固相载锌凹土体外消化前后化学组成和表征分析

4 小结

第六章 固相载锌凹凸棒石黏土对肉鸡大肠杆菌及其脂多糖的作用研究

1．1 试验材料

1．2 试验设计与方法

1．3 数据统计与分析

2 结果与分析

2．1 固相载锌凹土对肉鸡大肠杆菌MIC的研究

2．2 固相载锌凹土在不同时间对肉鸡大肠杆菌杀菌效果的研究

2．3 固相载锌凹土对肉鸡大肠杆菌MBC的研究

2．4 固相载锌凹土对肉鸡大肠杆菌菌体DNA、RNA含量的影响

2．5 固相载锌凹土吸附LPS的研究

3 讨论

4 小结

第七章 固相载锌凹凸棒石黏土对肉鸡锌相对生物利用率的研究

1．1 试验材料

1．2 试验设计与日粮

1．3 饲养管理

1．4 样品采集

1．5 指标测定

1．6 数据统计分析

2 结果与分析

2．1 不同锌源及锌水平对肉鸡生产性能的影响

2．2 不同锌源及锌水平对21d肉鸡组织锌含量的影响

2．3 不同锌源及锌水平对42d肉鸡组织锌含量的影响

2．4 固相载锌凹土中锌对21d肉鸡的生物利用率

2．5 固相载锌凹土中锌对42d肉鸡的生物利用率

3．1 不同锌源及锌水平对肉鸡生产性能的影响

3．2 不同锌源及锌水平对肉鸡组织锌含量及生物利用的影响

4 小结

第八章 固相载锌凹凸棒石黏土对肉仔鸡生产性能及免疫机能的影响

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 试验设计与日粮

1．3 饲养管理

1．4 样品采集

1．5 指标测定

1．6 数据统计分析

2 结果与分析

2．1 固相载锌凹土对肉仔鸡生产性能的影响

2．2 固相载锌凹土对肉仔鸡免疫器官指数的影响

2．3 固相载锌凹土对肉仔鸡血清免疫相关指标的影响

2．4 固相载锌凹土对肉仔鸡肠道黏膜免疫球蛋白含量的影响

2．5 固相载锌凹土对肉仔鸡肠道sIgA分泌细胞的影响

2．6 固相载锌凹土对肉仔鸡肠道回肠黏膜Toll样受体(TLRs)-NF-κB信号传导通路影响

3 讨论

3．1 固相载锌凹土对肉仔鸡生产性能影响

3．2 固相载锌凹土对肉仔鸡免疫机能的影响

3．3 固相载锌凹土对肉仔鸡回肠黏膜Toll样受体(TLRs)-NF-κB信号传导通路的影响

4 小结

第九章 固相载锌凹凸棒石黏土对肉仔鸡盲肠细菌区系的影响

1．1 试验材料

1．2 试验设计与日粮

1．3 饲养管理

1．4 样品采集

1．5 指标测定

1．6 数据分析

2 结果与分析

2．1 固相载锌凹土对肉鸡盲肠食糜细菌菌落数的影响

2．2 MiSeq测序技术对肉鸡盲肠细菌多样性分析

3 讨论

3．1 固相载锌凹土对肉仔鸡盲肠食糜细菌菌落数的影响

3．2 固相载锌凹土对肉仔鸡盲肠食糜细菌多样性的影响

4 小结

全文结论

本文创新点与有待进二步研究的问题

参考文献

致谢

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