淫羊藿苷和淫羊藿多糖对卵泡发育与抗氧化作用的影响

摘要

哺乳动物卵巢卵泡的发育与闭锁主要受到细胞死亡受体和生长促进因子的调控;生长促进因子既包括激素（如促性腺激素），也包括卵巢内调节因子（如性腺类固醇激素、细胞因子及胞内蛋白等）。动物卵巢含有大量的原始卵泡，往往仅有少数卵泡能够发育到排卵前的阶段或排卵;绝大多数卵泡会通过某种机制发生闭锁退化。死亡受体的激活或者缺少关键生长促进因子，可能是导致凋亡的主要原因。一般认为，氧化应激、辐射、毒素和药物等均可诱发细胞凋亡，卵巢颗粒细胞凋亡在卵泡闭锁中扮演着重要的角色。
　　淫羊藿(Epimedium)是小檗科淫羊藿属多种植物干燥茎叶的统称，传统上具有补肾阳、强筋骨、祛风湿的功能。淫羊藿苷(ICA)和淫羊藿多糖(EPS)是淫羊藿(EP)的主要有效成份。淫羊藿能够直接刺激大鼠卵泡颗粒细胞分泌雌二醇;淫羊藿苷可促进小鼠卵泡发育，使其发情周期提前，并能提高大鼠血清中SOD抗氧化酶的活性;淫羊藿多糖能够提高小鼠的卵巢子宫系数，并具有抗氧化作用;但迄今少有淫羊藿苷或淫羊藿多糖对小鼠卵泡卵母细胞体外发育和卵泡细胞抗氧化作用的报道。本试验通过研究淫羊藿有效成分对小鼠卵母细胞发育的影响，进而分析淫羊藿苷和淫羊藿多糖对卵泡细胞凋亡的影响及其抗氧化作用，以期评价淫羊藿苷和淫羊藿多糖对卵泡发育的促进作用，为淫羊藿有效成分的应用及卵母细胞体外培养提供有益的参考。试验结果如下:
　　1、淫羊藿苷和淫羊藿多糖对小鼠卵母细胞发育与成熟的影响
　　分别用不同剂量淫羊藿苷（ICA，0.1、0.3、0.5和0.7 mg）和淫羊藿多糖(EPS，2、4、6和8 mg)每天1次连续灌服小鼠7和14d，设置生理盐水灌服对照组。小鼠致死后按组采集卵巢有腔卵泡，分离卵母细胞置于M16培养液中作常规体外培养24h，检查小鼠卵母细胞第一极体(pbI)排出情况，统计卵母细胞体外成熟率。再将各组成熟卵母细胞分别进行体外受精，KSOM液中培养6h观察受精情况。结果显示，连续灌服7d淫羊藿苷0.5 mg组的pbI排出率均较对照组有显著提高（75.0％对63.3％;P＜0.05），并高于连续灌服14 d所获pbI排出率最高的淫羊藿苷0.3 mg组(68.1％;P＜0.05);淫羊藿多糖仅连续灌服7d的8 mg组pbI排出率较对照组显著升高(80％;P＜0.05)。连续灌服7d淫羊藿苷0.3 mg组的受精率较对照组明显提高（69.4％对41.1％;P＜0.05）;在连续灌服14 d组别中，与对照组相比淫羊藿苷和淫羊藿多糖组的受精率增加均不显著(P＞0.05)。
　　2.淫羊藿苷和淫羊藿多糖对小鼠发育的影响
　　连续7d分别用不同剂量淫羊藿苷（0.5和0.7 mg）和淫羊藿多糖（6和8 mg）灌服小鼠，生理盐水对照。每天记录小鼠情况，结束给药次日致死小鼠，称量并计算各组小鼠体重、增重和内脏指数（心、肝、脾、肺和肾）。结果显示，连续灌服7d淫羊藿苷和淫羊藿多糖对雌性小鼠体重、增重及内脏指数（心、肝、脾、肺和肾）均无显著影响(P＞0.05);但淫羊藿苷和淫羊藿多糖处理组均不同程度提前了母鼠的发情期。
　　3.淫羊藿苷和淫羊藿多糖对小鼠卵泡细胞凋亡的作用
　　健康小鼠连续7d灌服不同剂量淫羊藿苷（0.5和0.7 mg）和淫羊藿多糖（6和8 mg），生理盐水对照。分离收集各组小鼠卵泡细胞，用流式细胞仪检测各组卵泡细胞凋亡率，结果表明淫羊藿苷（0.5和0.7 mg）组和淫羊藿多糖(6 mg)组卵泡细胞凋亡率显著降低(P＜0.05);淫羊藿苷和口淫羊藿多糖处理组卵泡细胞早期凋亡率均有显著下降(P＜0.05)。采集各组卵泡细胞、卵巢和子宫组织，用RT-PCR检测凋亡基因Bax和抗凋亡基因Bcl-2表达，结果表明淫羊藿苷0.7 mg组卵泡细胞Bcl-2/Bax基因相对表达量比值显著提高(P＜0.05);但淫羊藿多糖6 mg组卵泡细胞Bcl-2/Bax基因相对表达量比值并无明显改变（P＞0.05），8 mg组反而显著降低(P＜0.05);淫羊藿苷和淫羊藿多糖处理对卵巢和子宫Bcl-2/Bax基因相对表达量比值的影响均不显著（P＞0.05）。
　　4.淫羊藿苷和淫羊藿多糖对小鼠卵泡细胞ROS和O2-的影响
　　连续7d灌服不同剂量淫羊藿苷（0.5和0.7 mg）和淫羊藿多糖（6和8 mg），生理盐水对照，分离采集各组小鼠卵泡细胞，用DCFH-DA法流式细胞仪检测活性氧(ROS)水平，用抗超氧阴离子自由基及产生超氧阴离子自由基测试盒检测超氧阴离子水平（O2-）。结果显示，淫羊藿多糖8 mg处理组卵泡细胞ROS和O2-水平显著提高(P＜0.05)，淫羊藿多糖6 mg处理组卵泡细胞ROS水平显著提高(P＜0.05);淫羊藿苷0.5和0.7 mg处理组卵泡细胞的ROS和O2-水平无显著变化(P＞0.05)。
　　5.淫羊藿苷和淫羊藿多糖对小鼠卵泡细胞抗氧化作用的影响
　　用不同剂量淫羊藿苷（0.5和0.7 mg）、淫羊藿多糖（6和8mg）和生理盐水（对照组）连续灌服小鼠7d，采集各组小鼠卵泡细胞，分别用超氧化物歧化酶试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶试剂盒和过氧化氢酶试剂盒检测卵泡细胞SOD、GPX和CAT活性。结果显示，淫羊藿苷和淫羊藿多糖处理均可不同程度地提高卵泡细胞GPX和CAT抗氧化酶活性，尤其是淫羊藿多糖8 mg组较对照组差异显著(P＜0.05);而各试验组SOD抗氧化酶活性则与对照组差异不显著（P＞0.05）。各组卵泡细胞、卵巢和子宫组织用RT-PCR检测抗氧化酶基因SOD1、SOD2和GPx1基因相对表达量，表明淫羊藿苷0.7 mg组的卵泡细胞SOD1、SOD2均有显著提高，且子宫GSH-PX1基因相对表达量显著增加(P＜0.05)。淫羊藿多糖8 mg组的SOD2和GSH-PX1基因表达量在卵泡细胞显著降低，而在子宫却显著升高。

目录

声明

摘要

符号及缩写语

第一章 卵泡发育与淫羊藿有效成分的应用

1．1 卵泡结构

1．2 原始卵泡库形成

1．3 卵泡发育与成熟

2 卵泡闭锁与颗粒细胞凋亡

2．1 卵泡闭锁的激素调节

2．2 Bcl-2家族对卵泡闭锁的作用

2．3 氧化应激对卵泡发育和闭锁的影响

2．4 卵泡细胞凋亡的检测

2．5 颗粒细胞对卵母细胞发育与成熟的影响

3 淫羊藿及其有效成分的研究与应用

3．1 淫羊藿的生物活性物质与药用价值

3．2 淫羊藿苷(ICA)

3．3 淫羊藿多糖(EPS)

第二章 淫羊藿苷和淫羊藿多糖对小鼠卵母细胞发育与卵泡细胞凋亡的影响

1 材料

1．1 主要仪器设备

1．2 主要试剂及药品

1．3 主要试剂的配置

2 方法

2．1 试验动物与分组

2．2 小鼠卵母细胞采集与体外成熟(IVM)

2．3 体外受精(IVF)

2．4 阴道涂片

2．5 卵巢和子宫的收集

2．6 卵泡细胞收集与凋亡检测

2．7 引物合成与样品总RNA提取

2．8 反转录合成cDNA与Real Time PCR检测

2．9 数据统计与分析

3 结果

3．1 淫羊藿苷与淫羊藿多糖对小鼠卵母细胞体外发育与成熟的影响

3．2 淫羊藿苷和淫羊藿多糖对小鼠发育的影响

3．3 淫羊藿苷和淫羊藿多糖对小鼠卵泡细胞凋亡的影响

4 讨论

5 小结

第三章 淫羊藿苷和淫羊藿多糖对小鼠卵泡细胞抗氧化作用的影响

1 材料

1．1 主要仪器

1．2 主要试剂及药品

1．3 主要试剂的配置

2 方法

2．1 试验动物与分组设计

2．2 卵泡细胞、卵巢与子宫样品收集

2．3 卵泡细胞蛋白浓度的测定

2．4 卵泡细胞活性氧(ROS)与超氧阴离子自由基(O2-)的测定

2．5 超氧化物歧化酶(SOD)的检测

2．6 谷胱甘肽过氧化酶(GSH-PX)检测

2．7 过氧化氢酶(CAT)的检测

2．8 引物合成与样品总RNA检测

2．9 数据统计与分析

3 结果

3．2 淫羊藿苷和淫羊藿多糖对小鼠卵泡细胞抗氧化酶活性与表达的影响

4 讨论

5 小结

全文总结

参考文献

致谢