空气暴露及运输胁迫对美洲鲥亲鱼生理生化指标及hsp70基因表达的影响

摘要

在水产养殖的生产管理中，操作胁迫是鱼类不可避免的一类应激因子，它包括换水、吸污、拉网、捕捉、离水、运输等多个环节，这些操作往往会对鱼体造成一定胁迫，进而引发鱼体代谢、内分泌、免疫系统等一系列的应激反应，给鱼类带来了巨大的负面影响。本试验以饲养在温室水泥池内性成熟的体质量(683.53±22.10)g的美洲鲥(Alosa sapidissima)亲鱼为研究对象，分别开展空气暴露和运输胁迫试验，通过检测应激前后美洲鲥亲鱼血液生理生化、组织酶活、激素以及组织hsp70 nRNA水平等多项指标，研究空气暴露和运输胁迫对美洲鲥亲鱼生理生化及机能的影响。
　　1.空气暴露对美洲鲥亲鱼多项生理生化指标产生显著影响。试验设置不进行空气暴露处理的对照组和空气暴露时间为15s、30s、60s三个不同强度处理组。美洲鲥亲鱼在空气暴露试验后其红细胞数量、红细胞压积、血红蛋白含量、血清过氧化氢酶、甲状腺素均有显著下降(P＜0.05);血糖、总胆固醇、甘油三酯、总蛋白、K+、Ca2+、超氧化物歧化酶、丙二醛、溶菌酶、谷胱甘肽S转移酶、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、皮质醇激素等均出现显著升高(P＜0.05);而红细胞平均血红蛋白含量、Na+、Cl-、三碘甲腺原氨酸等指标并无显著变化(P＞0.05)。鳃组织超氧化物歧化酶及过氧化氢酶活力在空气暴露15s、60s组均出现显著降低(P＜0.05);肝脏谷丙转氨酶、谷草转氨酶水平在空气暴露30s、60s显著升高(P＜0.05)，肝糖元含量显著下降(P＜0.05);心脏肌酸激酶仅在60s空气暴露组出现升高（P＜0.05），乙酰胆碱酯酶活力在15s、60s空气暴露组均显著下降(P＜0.05)。
　　2.运输胁迫对美洲鲥亲鱼多项生理生化指标亦产生显著影响。与运输前(运输0h)相比，实验组美洲鲥亲鱼的红细胞数量、红细胞压积、血红蛋白含量、甘油三酯、血清超氧化物歧化酶、甲状腺素等在运输2h、4h均有显著下降(P＜0.05);实验组血糖、总胆固醇、K+、Cl-、丙二醛、溶菌酶、谷胱甘肽S转移酶、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、皮质醇激素、三碘甲腺原氨酸等在运输2h、4h出现显著升高(P＜0.05);而实验组红细胞平均血红蛋白含量、Na+、Ca2+、过氧化氢酶与运输前相比并无明显差异(P＞0.05)。鳃组织Na+-K+-ATP酶和过氧化氢酶活力在运输2h、4h时出现显著下降(P＜0.05);肝组织过氧化氢酶、糖原含量在运输后出现显著下降(P＜0.05)，肝脏谷丙转氨酶、谷草转氨酶水平显著升高(P＜0.05);心脏肌酸激酶在运输4h时出现显著上升(P＜0.05)，乙酰胆碱酯酶活力在运输4h时出现明显下降(P＜0.05)。可见，运输应激能影响美洲鲥亲鱼的生理机能，使其鳃、肝、心脏出现一定程度的损伤。
　　3.运用同源克隆和cDNA末端快速扩增技术获取了美洲鲥热应激蛋白70(HeatShock Protein70，HSP70)的全长cDNA序列，其总长度为2545 bp，开放阅读框区为1914 bp，推测编码637个氨基酸，其氨基酸的二级结构含有HSP70家族的3个特征序列。氨基酸同源性分析显示，美洲鲥HSP70与墨西哥脂鲤(Astyanax mexicanus)等鱼类的相似性达84％以上，与无脊椎动物果蝇、大肠杆菌的相似性分别为73％和38％，表明其基因在进化上具有很高的保守性。
　　4.荧光定量PCR检测hsp70基因在各组织中的表达分布，该基因在美洲鲥鳃、肌肉、头肾中高表达，在脑和心脏中相对高表达，在肝脏、脾脏、肠、肾脏中微量表达。本研究中不同强度空气暴露胁迫后并未引起hsp70mRNA在鳃、头肾中的明显变化(P＞0.05)，肝脏hsp70 mRNA水平在15s、30s、60s空气暴露组均有显著升高(P＜0.05），而其升高幅度并不与操作胁迫的强度呈正相关。运输应激过程中鳃、肝脏hsp70 mRNA水平呈先升高后降低的变化趋势，头肾hsp70 mRNA水平呈现递增趋势。
　　综上表明，空气暴露和运输胁迫对美洲鲥亲鱼血液多项生理和生化指标以及鳃、肝、心脏组织酶活指标等均造成一定的影响。鱼体的呼吸及循环系统功能在应激后出现减弱，氧化应激反应导致了鳃、肝、心脏等组织受损。肝脏hsp70基因在空气暴露和运输胁迫下具有较好的应答，但鉴于hsp70基因对不同应激源应答的复杂性，仍需要进一步研究其在多种应激源下的反应，以便将其合理应用来提高鱼体抗性。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1 美洲鲥研究概况

1．1 主要生物学特征

1．2 国内外研究概述

2 鱼类应激生理研究

2．1 鱼类应激的概念

2．2 鱼类应激生理反应过程

2．3 鱼类应激常用的监测指标

3 鱼类热应激蛋白70的研究概况

3．1 热应激蛋白的早期研究

3．2 热应激蛋白的分类

3．3 鱼类hsp70基因的克隆

3．4 鱼类hsp70基因表达与调控

3．5 鱼类HSP70的功能

3．6 鱼类HSP70的应用

4 本研究的目的及意义

第二章 空气暴露对美洲鲥亲鱼血液生化、组织酶活及激素等指标的影响

1 材料与方法

1．1 试验鱼种及暂养

1．2 试验设计

1．3 样品采集与处理

1．4 主要指标的检测

1．5 数据处理

2 结果与分析

2．1 空气暴露胁迫下鱼体状况观察

2．2 空气暴露胁迫对美洲鲥亲鱼血液主要生理生化指标的影响

2．3 空气暴露胁迫对美洲鲥亲鱼血清酶活的影响

2．4 空气暴露胁迫对美洲鲥亲鱼组织酶活的影响

2．5 空气暴露胁迫对美洲鲥亲鱼血清激素的影响

3 讨论

3．1 空气暴露胁迫对血液生理和生化指标的影响

3．2 空气暴露胁迫对组织酶活的影响

3．3 空气暴露胁迫对血清激素的影响

第三章 运输应激对美洲鲥亲鱼血液生化、组织酶活及激素等指标的影响

1 材料与方法

1．1 试验鱼种及暂养

1．2 试验设计

1．3 样品采集与处理

1．4 指标检测

1．5 数据处理

2 结果与分析

2．1 运输应激期间鱼体状况观察

2．2 运输应激对美洲鲥亲鱼血液主要生理和生化指标的影响

2．3 运输应激对美洲鲥亲鱼血清酶活的影响

2．4 运输应激对美洲鲥亲鱼组织酶活的影响

2．5 运输应激对美洲鲥亲鱼血清激素的影响

3 讨论

3．1 运输应激对血液生理及生化指标的影响

3．2 运输应激对组织酶活的影响

3．3 运输应激对血清激素的影响

第四章 美洲鲥亲鱼hsp70基因全序列克隆与分析

1 材料与方法

1．1 试验鱼种

1．2 样品采集与处理

1．3 使用试剂和仪器

1．4 总RNA提取

1．5 cDNA模板的制备

1．6 引物设计与合成

1．7 hsp70基因保守区片段的克隆

1．8 hsp70基因RACE扩增

1．9 基因序列特征分析

1．10 氨基酸同源性比较和系统进化分析

2 结果与分析

2．1 美洲鲥亲鱼hsp70基因cDNA全长序列及分析

2．2 美洲鲥亲鱼HSP70氨基酸同源性比较

2．3 美洲鲥亲鱼HSP70蛋白的系统进化分析

3．讨论

第五章 空气暴露及运输胁迫对美洲鲥亲鱼不同组织hsp70基因表达的影响

1 材料与方法

1．1 试验鱼种

1．2 样品采集与处理

1．3 试验方法

1．4 数据处理

2 结果与分析

2．1 美洲鲥亲鱼hsp70基因mRNA组织表达差异

2．2 不同强度空气暴露胁迫下hsp70基因表达水平检测

2．3 运输应激下hsp70基因表达水平检测

3 讨论

3．1 美洲鲥hsp70基因在不同组织器官中的表达分布

3．2 不同强度空气暴露胁迫对美洲鲥亲鱼hsp70 mRNA表达的影响

3．3 运输对美洲鲥亲鱼hsp70基因mRNA表达水平的影响

全文结论

参考文献

致谢

攻读学位期间参加的科研项目和成果