草莓五倍体及其染色体加倍后的差异蛋白质组学研究

摘要

草莓是多倍体植物，不同倍性(2x、4x、6x、8x、10x)的种质资源在自然界中广泛存在。野生草莓作为栽培草莓抗病、抗逆、改良性状的重要基因库，育种实践中常常将栽培草莓与野生种草莓杂交来创造新种质。本研究采用两种不同的差异蛋白质组学研究方法，即双向电泳技术结合质谱技术以及同位素相对标记和绝对定量(iTRAQ)技术，以草莓种间杂交种及其加倍种为材料，研究草莓染色体加倍前后叶片差异表达蛋白质，以期获得在加倍过程中对草莓重要性状进行调控的关键基因。本研究主要从两个方面进行并取得以下结果:
　　1.以二倍体绿色草莓（Fragaria viridis Duch.）与八倍体栽培草莓‘房香’(F.×ananassa‘Fusanoka')杂交所得的草莓五倍体（代号:FxLs-11-37）及其染色体加倍而成的十倍体（代号:A3，2n=10 x=70）为试材，测定其农艺性状、SPAD值以及净光合速率，利用双向凝胶电泳技术对草莓染色体加倍过程中蛋白质含量进行分析。结果表明:与FxLs-11-37相比，A3表现出明显的株型矮化、植株冠茎变大，叶长叶宽增大、叶片增厚以及叶色浓绿等农艺性状特征，并且A3叶片的SPAD值与净光合速率显著高于FxLs-11-37;通过PDQuest软件对图谱进行分析，两者在等电点4-7、分子量14.4-66.2 kDa范围内蛋白质斑点分布最多，可识别的总蛋白质斑点数约700个，其中蛋白质表达差异水平在1.5倍以上的18个，2.0倍以上的有4个。利用MALDI-TOF-MS/MS质谱技术鉴定了这4个差异蛋白质，分别是草莓主要过敏原a1-E、核内不均一核糖核蛋白1、叶绿体硫辛酰基合酶1、NAD(P)H脱氢酶（醌）FQR1类似蛋白质。通过荧光定量PCR检测了这4个差异蛋白质编码基因的表达量，其在两种草莓中的表达差异与蛋白质表达差异总体一致。分析表明:这些差异蛋白质主要与抗逆、mRNA转运、物质与能量代谢相关。
　　2.利用iTRAQ技术对绿色草莓和八倍体‘红颊’草莓（F.×ananassa‘Benihoppe’）杂交所得的草莓五倍体（代号:HjLs-11-09）及其染色体加倍后代(代号:D-H-09-01，2n=10x=70)的幼嫩叶片进行蛋白质分离与鉴定。主要研究结果如下:差异表达倍数1.5倍以上的蛋白质有118个，其中106个为上调，12个为下调;差异表达倍数2.0以上的蛋白质有15个，其中13个为上调，2个为下调。通过GO功能统计，差异表达蛋白在生物学过程中主要参与了蛋白水解、脂质转运、DNA依赖性转录调控、mRNA加工、蛋白质折叠、核mRNA剪接，核小体组装、细胞分裂等过程，在细胞组分中主要定位于细胞核、细胞质、细胞器及胞外区、质膜以及整合膜蛋白等系统组分;在分子功能方面主要包括酶催化活性功能和结合功能。根据差异表达蛋白KEGGpathway通路的显著富集分析，差异表达蛋白主要参与了碳水化合物代谢，遗传信息，信号传导，能量代谢处理途径等途径等通路。荧光定量qRT-PCR分析显示，显著差异表达蛋白质相应的基因在转录水平上的表达趋势与蛋白质水平趋势基本一致。分析表明:这些在叶片中显著差异蛋白在染色体加倍后，主要参与了叶绿素代谢、信号转导、次级代谢以及应激防御途径，其中涉及叶绿素代谢的差异蛋白质最多。与叶绿素代谢相关蛋白质:细胞色素P45081D1、脱镁叶绿酸a氧化酶、29 kDa叶绿体核蛋白A;信号转导相关蛋白质:外消旋GTP结合蛋白5、激发剂响应蛋白3;与次级代谢相关蛋白质:GDSL酯酶/脂酶At5g03810;与应激反应和防御相关蛋白质:热激同源70 kDa蛋白。

目录

声明

摘要

缩略词

第一章 文献综述

1 植物多倍化概述

1．1 植物多倍化及其意义

1．2 多倍化植物的分子研究

2 草莓倍性育种的重要性

2．1 草莓杂交育种

2．2 草莓染色体加倍研究

3 蛋白质组学概述

3．1 蛋白质组学的概念及研究内容

3．2 蛋白质分离技术-双向凝胶电泳和iTRAQ技术

3．3 植物蛋白质组的研究进展

3．4 蛋白质组学在草莓中的研究应用

4 蛋白质组学在植物倍性中的研究应用

5 研究的目的与意义

参考文献

第二章 草莓五倍体及其染色体加倍后的双向电泳差异蛋白质分析

1 材料与方法

1．1 材料与染色体加倍

1．2 试剂和设备

1．3 农艺性状测定

1．4 SPAD值和净光合速率测定

1．5 蛋白质提取

1．6 双向凝胶电泳

1．7 凝胶扫描及质谱分析

1．8 差异蛋白质相关基因的qRT-PCR分析

2 结果与分析

2．1 染色体加倍后农艺性状、SPAD值和净光合速率的变化

2．2 FxLs-11-37与A3草莓嫩叶差异蛋白相关分析

2．3 差异蛋白质相关基因的表达分析

3 讨论

参考文献

第三章 草莓五倍体及其染色体加倍后的iTRAQ蛋白质组学分析

1 材料与方法

1．1 材料与染色体加倍

1．2 试剂和设备

1．3 蛋白质提取

1．4 多肽的iTRAQ标记

1．5 强阳离子交换柱(SCX)分离

1．6 基于Triple TOF 5600的液相串联质谱分析

1．7 蛋白质组数据生物信息分析

1．8 差异蛋白质相关基因的qRT-PCR分析

2 结果与分析

2．1 SDS-PAGE及样品总蛋白质量检测

2．2 肽段质量误差分布

2．3 重复相关性分析

2．4 蛋白质鉴定结果与分析

2．5 差异蛋白筛选

2．6 差异表达蛋白的GO分析

2．7 差异蛋白质的KEGG注释

2．8 差异蛋白质的KOG注释

2．9 差异蛋白质相关基因的表达分析

3 讨论

3．1 与叶绿素代谢相关蛋白质

3．2 与信号转导相关蛋白质

3．3 与应激和防御相关蛋白质

3．4 与代谢相关蛋白质

3．5 其它蛋白质

3．6 染色体加倍过程中差异表达蛋白质与其差异表达基因的比较

参考文献

全文结论

主要创新点

攻读硕士期间发表论文

致谢