堆肥菌株Aspergillus fumigatus Z5对稻草的降解及其多糖单加氧酶的异源表达研究

摘要

木质纤维素是自然界中分布最广泛且含量最多的生物质资源，作为植物细胞壁的主要组成部分，结构复杂，难以分解，利用自然界微生物产生的木质纤维素酶来分解木质纤维素，这对解决环境污染，能源危机，食品短缺和人类可持续发展具有重要意义。
　　木质纤维素分解是堆肥过程中主要的生物化学反应，是由微生物分泌的木质纤维酶通过水解作用来完成的，木质纤维素酶活力的大小将直接影响堆肥效率的高低。选择南京农业大学植物营养微生物实验室分离筛选的高效纤维素分解菌A.fumigatusZ5，将其接种在以稻草秸秆作为唯一碳源的曼德尔培养基中，研究其对稻草的降解，结果显示，稻草秸秆中的纤维素和半纤维素容易分解，木质素较难分解。多糖单加氧酶(PMOs)，又称糖苷水解酶家族(GH61)，在木质纤维素分解过程中发挥了重要作用。本研究拟采用荧光定量PCR方法研究菌株A.fumigatus Z5中GH61家族基因在不同碳源代谢下的转录差异;通过构建酵母X33表达载体，异源表达菌株Z5中多糖单加氧酶(PMOs)基因，经亲和层析纯化获得重组PMOs蛋白并研究其酶学特性;详尽的阐明PMOs的功能，揭示催化木质纤维素分解及与木质纤维素酶协同作用提高催化效率的机制，为提高堆肥效率提供理论基础。
　　本实验选用的是毕赤酵母表达系统，它能进行蛋白的加工，而且能够进行蛋白折叠，及翻译等修饰作用。而且操作简单、廉价，且表达水平更高。外源蛋白表达水平很高。本试验以毕赤酵母X33作为表达宿主，设计特异性引物，以A.fumigatus Z5 RNA反转录得到的cDNA分别扩增多糖单加氧酶(PMOs)基因，并连接到毕赤酵母表达载体pPICZαA上，最后转化到毕赤酵母X33表达。结果表明，成功得到三种纯化后的多糖单加氧酶(PMOs)蛋白。

目录

声明

论文说明

摘要

第一章 文献综述

1 木质纤维素特征及其分解

1．1 木质纤维素简介

1．2 木质纤维素的分解

2 高效木质素纤维素分解茵在堆肥中的应用及其限制因子

2．1 高效木质素纤维素分解菌

2．2 高效木质素纤维素分解菌在堆肥中的应用及其限制因子

3 多糖单加氧酶的分类及其木质纤维素分解增效作用

3．1 多糖单加氧酶的分类

3．2 PMOs的作用机制及对木质纤维素分解增效作用

4 巴斯德毕赤酵母表达系统

4．1 毕赤酵母表达系统的优点

4．2 毕赤酵母表达载体的种类和转化方法

5 本研究目的、意义及技术路线

5．1 研究目的及意义

5．2 研究技术路线图

参考文献

第二章 堆肥菌株A．fumigatus Z5对稻草的降解研究

1 材料与方法

1．1 实验材料

1．2 实验方法

2 结果与分析

2．2 菌株Z5降解稻草过程中不同胞外酶活的测定

2．3 菌株Z5降解稻草过程中菌株Z5的定量

2．4 菌株Z5降解稻草过程中对稻草秸秆表面的分析

2．5 菌株Z5降解稻草过程中对稻草秸秆的红外光谱分析，X射线光电子光谱分析

3 讨论

4 小结

第三章 A．fumigatus Z5多糖单加氧酶基因的转录分析

1 材料与方法

1．1 菌株及培养基

1．2 试剂与仪器

1．3 A．fumigatus Z5总RNA的提取

1．4 A．fumigatus Z5的反转录及cDNA的合成

1．5 引物的设计

1．6 内参基因和糖苷水解酶61家族(GH61s)相关基因的半定量和实时荧光定量PCR(Real．time PCR)

2 结果与分析

2．1 RNA样品质量检测

2．2 半定量结果和实时荧光定量PCR(Realtime PCR)结果分析

3 讨论

4 小结

第四章 A．fumigatus Z5多糖单加氧酶基因的异源表达

1 材料与方法

1．1 菌株，质粒及培养基

1．2 主要仪器

1．3 实验方法

2 结果与分析

2．2 PMO-1，PMO-5，PMO-8基因克隆

2．3 表达载体的构建

2．4 毕赤酵母的转化，筛选和鉴定

2．7 PMO-1，PMO-5，PMO-8的质谱分析

2．8 重组PMO-1，PMO-5，PMO-8酶学特性的分析

3 讨论

4 小结

全文结论

创新点

附录

硕士期间已(待)发表的论文

致谢