甜菜夜蛾对三氟氯氰菊酯的抗性机制

摘要

甜菜夜蛾Spodoptera exigua(Hübner)是一种广泛性分布的多食性重要农业害虫，对于蔬菜、棉花和其他一些作物造成严重的危害。生产上甜菜夜蛾的防治主要依赖化学杀虫剂，由于杀虫剂的大量使用，使得抗药性问题日益突出。拟除虫菊酯类杀虫剂以及氰氟虫腙与茚虫威是生产了防治甜菜夜蛾的常用药剂品种，其作用靶标是电压门控钠离子通道。本文报道了广东省惠州市2014年甜菜夜蛾田间种群对三氟氯氰菊酯、茚虫威和氰氟虫腙三种杀虫剂的抗性状况，克隆得到了甜菜夜蛾钠离子通道的全长序列，通过比对抗性品系和敏感品系钠离子通道基因的氨基酸序列差异，分析电压门控钠离子通道突变与抗性的关系。同时还对抗性品系与敏感品系间钠离子通道基因的选择性剪切进行了研究，试图揭示甜菜夜蛾对三氟氯氰菊酯、氰氟虫腙以及茚虫威的抗性机制。同时还报道了甜菜夜蛾电压门控钠离子通道辅助蛋白基因。
　　1.甜菜夜蛾的抗性监测
　　采用浸叶法对2014年采自广东惠州的甜菜夜蛾田间种群对三氟氯氰菊酯、茚虫威和氰氟虫腙的抗药性水平进行了测定三种药剂进行了生物测定，与敏感品系相比，该地区甜菜夜蛾田间种群对三氟氯氰菊酯的抗性倍数达极高水平（309.5倍），对茚虫威与氰氟虫腙的抗性达高水平，分别为这三种杀虫剂的抗性倍数分别为309.5、85.3倍与42.5倍。分别采用这3种药剂对该种群进行室内抗性筛选，8代筛选后对三氟氯氰菊酯的抗性水平进一步上升达398倍，氰氟虫腙的筛选使抗性略有上升达60倍，而茚虫威的筛选并未使抗性进一步上升（85.5倍）。
　　2.甜菜夜蛾电压门控钠离子通道基因克隆与突变位点检测
　　本文首次报道了甜菜夜蛾电压门控钠离子通道基因的全长序列，该基因编码1794个氨基酸的蛋白质，具有电压门控钠离子通道的典型结构特征。比对分析对甜菜夜蛾抗性品系与敏感品系间钠离子通道基因的ORF的碱基序列与推定氨基酸序列，结果发现钠离子通道序列中存在大量的核苷酸碱基多态性，但翻译的氨基酸序列上在抗性品系与敏感品系之间并未发现稳定的突变，仅存在部分氨基酸多态性，表明该抗性品系对三氟氯氰菊酯的极高水平抗性与该电压门控钠离子通道突变似乎没有关系。
　　3.电压门控钠离子通道基因剪接体的研究
　　在得到甜菜夜蛾电压门控钠离子通道基因全长序列的基础上，对该基因的选择性剪切进行了研究。从甜菜夜蛾幼虫表达基因中得到了电压门控钠离子通道的9个不同转录本，这9个不同的转录本是由于在基因的5'末端发生选择性剪切所致。我们对这些转录本进行了蛋白结构域预测分析，发现，转录本SeNav-Seq1与SeNav-Seq6缺失了的全部结构域Ⅰ以及结构域Ⅱ的S1-S5α螺旋，而转录本SeNav-Seq3缺失的结构域Ⅰ的S1-S5α螺旋，转录本SeNav-Seq9存在着完整的结构域。对其中4个转录本的表达水平进行了定量分析，结果发现在甜菜夜蛾抗、感两个品系之间各转录本的表达水平存在显著差异，敏感品系中具有完整结构域的SeNav-Seq9表达水平显著高于抗性品系，而缺失结构域Ⅰ与结构Ⅱ的转录本（SeNav-Seq1和SeNav-Seq6）在抗性品系中表达水平显著高于敏感品系。仅缺失结构域Ⅰ的转录本SeNav-Seq3也是敏感品系中表达水平高于抗性品系。用三氟氯氰菊酯处理敏感品系幼虫后这些转录本的表达水平也发生变化，表现为具完整结构域的SeNav-Seq9表达水平显著下调，缺失结构域Ⅰ的SeNav-Seq3也表达下调，而转录本SeNav-Seq1表达水平显著上升，SeNav-Seq6表达水平略有上升但无显著差异。
　　4.电压门控钠离子通道辅助蛋白研究
　　昆虫电压门控钠离子通道的正常功能需要另一亚基（辅助蛋白）的协同作用。本文主要报道了甜菜夜蛾钠离子通道辅助蛋白的基因克隆，得到了TipE和Teh1-3全长序列，它们的碱基长度最短947bp，最长1606bp。同样利用荧光定量方法测定了这4个辅助蛋白基因在甜菜夜蛾不同组织的相对表达水平，结果发现在体壁、头部、中肠、马氏管和脂肪体中这4个基因均有表达。但这些辅助蛋白与三氟氯氰菊酯的极高水平抗性是否存在相关还有待于进一步的研究。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 甜菜夜蛾的发生与危害

1．2 甜菜夜蛾的化学防治与抗药性现状

1．3 甜菜夜蛾对杀虫剂的抗性机制

1．4 电压门控钠离子通道与抗药性

1．4．1 哺乳动物钠离子通道结构

1．4．2 昆虫钠离子通道的研究现状

1．4．3 作用于昆虫钠离子通道的杀虫剂

1．4．4 电压门控钠离子通道的选择性剪切

1．5 本研究的目的与意义

第二章 甜菜夜蛾抗性监测与突变检测

2．1 材料与方法

2．1．1 供饲昆虫以及饲养方法

2．1．2 供试试剂

2．1．3 主要仪器

2．1．4 甜菜夜蛾的生物测定与抗性筛选

2．1．5 引物设计

2．1．6 基因克隆

2．1．7 序列与分析

2．2 结果与分析

2．2．1 生物测定与抗性筛选

2．2．2 电压门控钠离子通道基因克隆

2．2．3 甜菜夜蛾电压门控钠离子通道的蛋白结构域分析

2．2．4 电压门控钠离子通道基因突变位点的检测

2．3 讨论

第三章 甜菜夜蛾钠离子通道剪接体的研究

3．1 材料与方法

3．1．1 供试昆虫及饲养方法

3．1．2 供试试剂

3．1．3 主要仪器

3．1．4 钠离子通道基因剪接体克隆与定量分析

3．1．5 甜菜夜蛾钠离子通道基因组DNA克隆

3．2 结果与分析

3．2．1 钠离子通道剪接体的克隆与蛋白结构域预测

3．2．2 甜菜夜蛾基因组的克隆

3．2．3 钠离子通道不同转录本的表达差异

3．3 讨论

第四章 甜菜夜蛾钠离子通道辅助蛋白基因克隆

4．1 材料与方法

4．1．1 供试昆虫及饲养方法

4．1．2 供试试剂

4．1．3 主要仪器

4．1．4 基因克隆

4．1．5 序列分析

4．1．6 基因表达水平分析

4．2 结果与分析

4．2．1 电压门控钠离子通道辅助蛋白基因的克隆

4．2．2 电压门控钠离子通道辅助蛋白基因的系统进化比较

4．2．3 辅助蛋白基因在甜菜夜蛾幼虫不同组织的表达差异

4．3 讨论

全文总结

参考文献

致谢