日粮蛋白质水平对大鼠和仔猪机体代谢和肠道微生物的影响

摘要

高蛋白日粮增加肠道微生物的蛋白质发酵，不利于仔猪肠道健康，同时会造成动物氮排放增加和蛋白质资源的浪费。然而高蛋白日粮对仔猪机体代谢谱、肠道内微生物区系和肠道上皮基因表达谱的影响不还清楚。本研究先使用大鼠模型，揭示高蛋白日粮对机体代谢和肠道稳态的影响，为高蛋白日粮对仔猪肠道影响提供参考。同时结合前人使用高蛋白日粮对仔猪的研究结果，本研究进一步围绕低蛋白氨基酸平衡日粮（日粮蛋白质水平减少4个百分点），探讨其对仔猪生长性能、机体代谢和肠道微生物的影响。试验结果如下:
　　1高蛋白日粮对大鼠机体代谢的影响
　　高蛋白低碳水化合物日粮能够引起体重降低，然而高蛋白日粮对机体整体代谢的影响还不清楚。本文旨在使用生化分析和代谢组学方法，研究高蛋白日粮对大鼠机体代谢的影响。选取20只体重180-200 g的雄性Wistar大鼠，随机分成2组:正常蛋白日粮组（20％蛋白质，56％碳水化合物）和高蛋白日粮组（45％蛋白质，30％碳水化合物），两种日粮的能量和脂肪水平一致，每组10个重复，饲养周期为6周，试验期结束后，采集大鼠血浆、尿液，用于生化指标和液相色谱-质谱代谢组学分析;采集组织器官，称重。结果显示，高蛋白日粮组大鼠体重、肠系膜脂肪组织和附睾脂肪重量显著低于正常蛋白日粮组(P＜0.05)，采食量和能量摄入降低。与正常蛋白日粮组相比，高蛋白日粮增加了血浆尿素和高密度脂蛋白浓度，减少了血浆甘油三酯和葡萄糖浓度(P＜0.05)。代谢组学分析表明，高蛋白日粮显著改变机体的代谢谱特征。高蛋白日粮增加血浆中生育酚、丙酮酸、2-羰基异己酸和β-羟基丁酸相对浓度(P＜0.05)，减少了亚油酸、棕榈酸、α-甘油磷酸和丙谷氨酸等物质的相对浓度(P＜0.05);高蛋白日粮减少尿液中能量代谢相关的物质，如柠檬酸、α-酮戊二酸、苹果酸的相对浓度，增加棕榈酸和硬脂酸相对浓度(P＜0.05)。高蛋白日粮改变了机体多种代谢途径，包括三羧酸循环、胰岛素信号和糖酵解等过程。代谢标记物分析发现血浆中的尿素和丙酮酸，以及尿液中的柠檬酸能够作为高蛋白日粮摄八的代谢标志物。基于相关性的代谢组学分析发现，摄入高蛋白日粮后，血浆中代谢物之间的相关性增加，血浆中能量代谢相关的α-酮戊二酸与血浆中苯丙氨酸、蛋氨酸和色氨酸呈现显著的正相关(P＜0.05)。在正常蛋白组，血浆中的缬氨酸和尿液中的β-羟基丁酸呈显著负相关（P＜0.05）;在高蛋白组，血浆中的2-羰基异己酸和尿液中的丙酮酸以及丝氨酸呈显著负相关(P＜0.05)。以上结果表明，高蛋白日粮显著改变了机体的代谢表型，影响机体能量代谢和脂肪代谢等过程。
　　2高蛋白日粮对大鼠粪样微生物区系的影响
　　日粮蛋白质水平的变化可能引起肠道微生物组成的变化。本文旨在研究高蛋白日粮饲喂过程中，大鼠肠道微生物定植的变化。在正式试验的第0、1、2、4、6周的最后一天采集大鼠粪样，通过PCR-DGGE、实时荧光定量PCR分析粪样微生物组成，气相色谱法分析肠道微生物代谢物的变化。DGGE分析表明高蛋白日粮改变粪样中微生物区系。高蛋白日粮增加大鼠粪样中Dorea，Coprococcus属的某些细菌，减少Flavonifractor，Blautia，Akkermansia属细菌。定量PCR分析表明高蛋白日粮增加大肠杆菌属细菌数量，减少双歧杆菌属和Akkermansiamuciniphila细菌数量(P＜0.05)。气相色谱分析显示高蛋白日粮显著减少粪样中短链脂肪酸乙酸、丙酸、丁酸的浓度(P＜0.05)。以上结果表明，高蛋白日粮改变了大鼠粪样中微生物区系，其中潜在致病菌的增加和有益菌的减少暗示高蛋白日粮可能破坏肠道稳定。
　　3高蛋白日粮对大鼠结肠微生物及代谢的影响
　　粪样微生物的变化表明日粮对肠道微生物的改变，而高蛋白日粮对大鼠结肠微生物组成及代谢的影响还不清楚。本文通过高通量测序和微生物代谢产物分析，研究高蛋白日粮对肠道环境的改变。大鼠采食不同蛋白质水平日粮6周后，采集结肠食糜，提取基因组DNA，使用16S核糖体RNA高通量测序分析结肠微生物组成，结合气相色谱和液相色谱方法分析微生物代谢物的变化，并对食糜中游离的代谢物进行分析。结果显示，高蛋白日粮增加结肠微生物区系的多样性(P＜0.05)，在属水平上，高蛋白日粮增加结肠中大肠杆菌属、肠球菌属、链球菌属、拟杆菌属以及硫酸盐还原菌等细菌，减少双歧杆菌属和瘤胃球菌属等细菌(P＜0.05);在细菌种水平上，高蛋白日粮增加Escherichia coli，Bacteroides vulgatus，Enterococcus faecium等细菌，减少Ruminococcus bromii，Faecalibacteriumprausnitzii和Akkermansia muciniphila等细菌(P＜0.05)。高蛋白日粮增加结肠食糜中尸胺、精胺和硫化物浓度，减少丁酸浓度（P＜0.05）。高蛋白日粮增加结肠食糜中氨基酸和核酸代谢物的相对浓度，减少脂肪酸类物质的相对浓度(P＜0.05)。以上结果表明，高蛋白日粮导致结肠食糜中对肠道健康具有不利作用的细菌和代谢物增加，影响肠道健康。
　　4高蛋白日粮对大鼠结肠上皮代谢和免疫相关基因表达的影响
　　大鼠结肠微生物和代谢物的变化可能对肠道上皮产生影响。本文通过转录组学方法，研究高蛋白日粮对结肠上皮代谢和免疫相关基因的影响。采集饲喂6周后大鼠的结肠上皮组织，提取总RNA，进行基因芯片和荧光定量PCR分析。通过基因芯片技术筛选出差异基因，使用DAVID和KEGG数据库进行富集分析。结果显示，高蛋白日粮上调参与疾病发生过程的基因表达（P＜0.05），包括趋化应答，肿瘤坏死因子α信号过程，氧化应激和凋亡。高蛋白日粮下调参与免疫保护过程的基因表达(P＜0.05)，包括固有免疫，氧连接的粘蛋白糖基化，氧化磷酸化。对基因表达、微生物和代谢物进行相关性分析，发现大肠杆菌属、肠球菌属和链球菌属细菌的丰度和参与趋化作用、肿瘤坏死因子信号途径、抗原提呈过程的基因存在显著正相关关系（P＜0.05），暗示这些细菌可能介导高蛋白日粮对结肠的不利影响。以上结果表明，高蛋白日粮可能改变大鼠结肠上皮免疫和代谢稳定，增加疾病风险。
　　5低蛋白氨基酸平衡日粮对仔猪生长性能和血清生化指标的影响
　　为了研究低蛋白氨基酸平衡日粮对仔猪生长性能和血清生化指标的影响。试验选用体重相近（12.02±0.52 kg）的健康杜长大生长猪，分为2组:正常蛋白组（20％蛋白质），低蛋白氨基酸平衡日粮（16％蛋白质）。每组5个重复，每个重复8-10头猪，试验期35天，在77日龄屠宰采样。结果显示，低蛋白氨基酸平衡日粮对生长性能无显著影响，显著减少粗脂肪的表现消化率（P＜0.05），显著减少胰腺重量（P＜0.05），显著减少血清葡萄糖和胆固醇的浓度(P＜0.05)。氨基酸分析显示，低蛋白氨基酸平衡日粮显著减少血清中总氨基酸和总必需氨基酸浓度(P＜0.05)，显著减少血清中苯丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、组氨酸和精氨酸浓度(P＜0.05)，对色氨酸、赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸、丙氨酸、甘氨酸、谷氨酸和谷氨酰胺浓度无显著影响(P＞0.05)。低蛋白氨基酸平衡日粮显著减少回肠食糜中色氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、丙氨酸、甘氨酸的浓度（P＜0.05），对其他氨基酸的浓度无显著影响(P＞0.05)。以上结果表明，低蛋白氨基酸平衡日粮对仔猪生长性能无显著影响，降低血清和回肠食糜中氨基酸浓度，影响仔猪支链氨基酸代谢等过程。
　　6低蛋白氨基酸平衡日粮对仔猪血清代谢谱的影响
　　本试验使用高通量代谢组学技术，研究低蛋白氨基酸平衡日粮对仔猪血清代谢谱的影响。采集77日龄仔猪的血清样品，用于气相色谱-飞行时间质谱分析。结果表明，低蛋白氨基酸平衡日粮改变血清中代谢物组成。PLS-DA和OPLS-DA分析表明低蛋白氨基酸平衡日粮组和正常蛋白纽处于不同的聚类簇。和正常蛋白日粮相比，低蛋白氨基酸平衡日粮显著增加血清中单甘油棕榈酸、甘油、硬脂酸、β-丙氨酸、丙二酸和棕榈酸的相对浓度(P＜0.05)，显著减少血清中瓜氨酸、鸟氨酸、哌啶甲酸和酪氨酸的相对浓度(P＜0.05)。代谢物富集分析显示低蛋白氨基酸平衡日粮显著影响了与丙酸代谢、甘油酯代谢、脂肪酸代谢、线粒体脂肪酸延伸和儿荼酚胺合成等有关的过程(P＜0.05)。受试者工作特征分析显示结合鸟氨酸、瓜氨酸、β-丙氨酸和酪氨酸四种氨基酸代谢类物质，能够很好的区分正常蛋白组和低蛋白氨基酸平衡日粮组。以上结果表明，低蛋白氨基酸平衡日粮主要影响仔猪体内精氨酸代谢、β-丙氨酸代谢、脂肪酸代谢、微生物赖氨酸代谢和酪氨酸代谢等过程，对能量代谢过程无显著影响。
　　7低蛋白氨基酸平衡日粮对仔猪肠道微生物及肠道上皮基因表达影响
　　本文旨在研究低蛋白氨基酸平衡日粮对仔猪回肠和结肠食糜微生物区系及肠上皮的影响。采集77日龄仔猪回肠和结肠食糜分析主要微生物组成和代谢产物，采集肠黏膜组织分析炎症因子的基因表达。结果显示，低蛋白氨基酸平衡日粮对回肠和结肠的影响不同。低蛋白氨基酸平衡日粮对回肠微生物数目无显著影响(P＞0.05)，显著减少回肠食糜中氨氮、酪胺、亚精胺浓度（P＜0.05），显著增加回肠食糜中色胺浓度(P＜0.05)，下调回肠黏膜Tlr5和Ifnγ mRNA的表达（P＜0.05）。在结肠，低蛋白氨基酸平衡日粮显著减少总菌和厚壁菌门细菌的数目(P＜0.05)，增加结肠食糜中氨氮、丁酸、对甲酚和吲哚浓度(P＜0.05)，对结肠食糜中生物胺的浓度无显著影响(P＞0.05)，对结肠黏膜细胞因子的表达无显著影响(P＞0.05)。低蛋白氨基酸平衡日粮对回肠和结肠食糜中乳酸杆菌属和双歧杆菌属细菌的数量无显著影响(P＞0.05)。低蛋白氨基酸平衡日粮对黏膜免疫球蛋白的表达无显著影响(P＞0.05)。以上结果表明，低蛋白氨基酸平衡日粮对仔猪的微生物组成和代谢的影响存在肠段差异，减少回肠食糜中蛋白质发酵的产物，增加结肠食糜中芳香族氨基酸发酵和丁酸产生，下调回肠黏膜促炎症因子的表达，低蛋白氨基酸平衡日粮对肠道微生物及免疫无明显不利影响。
　　综上所述，通过使用大鼠模型，本研究发现高蛋白日粮对机体代谢和肠道健康不利，增加促炎症相关的微生物、代谢物和基因表达。低蛋白氨基酸平衡日粮改变仔猪体内氨基酸代谢，对肠道微生物及免疫产生的效应优于高蛋白日粮。

目录

声明

摘要

本文部分缩略词的中英文对照

引言

文献综述

1．1 蛋白质摄入调节体重和采食量

1．2 不同蛋白质水平日粮对代谢的调节

2 蛋白质水平对肠道微生物的调节的研究

2．1 动物肠道微生物组成

2．2 微生物代谢物及功能

2．3 蛋白质水平对肠道微生物组成及代谢的影响

3 蛋白质水平的变化对肠道宿主微生物互作的影响研究

3．1 肠道宿主微生物互作

3．2 日粮蛋白质水平对肠道健康的影响

4 组学技术在肠道微生物和机体互作研究中的应用

4．1 微生物组学

4．2 转录组学

4．3 代谢组学

5 本研究的目的意义和研究框架

5．1 本研究的目的意义

5．2 本研究的框架

第一章 高蛋白日粮对大鼠机体代谢的影响

1 材料与方法

1．1 试验动物和日粮

1．2 试剂与仪器

1．3 试验设计和样品采集

1．4 血浆生化指标检测

1．5 代谢组学分析

1．6 尿液中部分物质的浓度检测

1．7 数据处理和统计分析

2 结果

2．1 高蛋白日粮对大鼠体重和采食量的影响

2．2 高蛋白日粮对大鼠血浆生化指标的影响

2．3 高蛋白日粮对大鼠血浆和尿液代谢物总离子图的影响

2．4 高蛋白日粮对大鼠血浆和尿液代谢物组成和浓度的影响

2．5 高蛋白日粮对大鼠血浆和尿液代谢标志物的影响

2．6 高蛋白日粮对大鼠血浆和尿液代谢物相关性网络的影响

3 讨论

3．1 能量代谢

3．2 支链氨基酸代谢

3．3 碳水化合物代谢

3．4 脂代谢

3．5 代谢物相关网络

4 本章小结

参考文献

第二章 高蛋白日粮对大鼠粪样微生物区系的影响

1 材料与方法

1．1 试验设计和样品采集

1．2 试剂与仪器

1．4 PCR-DGGE

1．5 细菌16S rRNA荧光定量PCR

1．6 短链脂肪酸(SCFAs)检测

1．7 数据处理和统计分析

2 结果

2．1 高蛋白日粮对大鼠粪样微生物区系的影响

2．2 高蛋白日粮对大鼠粪样主要微生物菌群数量的影响

2．3 高蛋白日粮对大鼠粪样挥发性脂肪酸浓度的影响

3 讨论

4 本章小结

参考文献

第三章 高蛋白日粮对大鼠结肠微生物及代谢的影响

1 材料和方法

1．1 试验设计

1．2 试剂和仪器

1．3 结肠总菌DNA提取

1．4 16S rRNA高通量测序

1．5 高通量测序数据分析

1．6 菌群荧光定量PCR检测

1．7 细菌代谢产物检测

1．8 食糜气相色谱-质谱(GC-MS)代谢组分析

1．9 数据处理与统计分析

2 结果

2．1 高蛋白日粮对结肠微生物分类和组成的影响

2．2 高蛋白日粮对大鼠结肠微生物16S基因拷贝数的影响

2．3 高蛋白日粮对大鼠结肠食糜微生物代谢物的影响

2．4 高蛋白日粮对大鼠结肠食糜代谢物组成的影响

2．5 代谢物和细菌丰度的相关性

3 讨论

4 本章小结

参考文献

第四章 高蛋白日粮对大鼠结肠上皮代谢和免疫相关基因表达的影响

1 材料和方法

1．1 试验设计

1．2 试剂和仪器

1．3 RNA提取与基因表达谱芯片检测

1．4 差异表达基因和生物学通路分析

1．5 Real-time PCR验证芯片

1．6 统计分析

2 结果

2．1 高蛋白日粮对大鼠结肠上皮基因表达和基因富集途径的影响

2．2 高蛋白日粮对大鼠结肠上皮基因表达信号网络的影响

2．3 定量PCR验证大鼠结肠上皮差异基因的表达

2．4 黏膜基因表达、结肠食糜微生物丰度和代谢产物相关性

3 讨论

4 本章小结

参考文献

第五章 低蛋白氨基酸平衡日粮对仔猪生长性能和血清生化指标的影响

1 材料和方法

1．1 试验材料

1．2 试验设计

1．3 化学成分分析

1．4 血液生化指标分析

1．5 血清和食糜氨基酸分析

1．6 数据处理与统计分析

2 结果

2．1 低蛋白氨基酸平衡日粮对仔猪生长性能和器官指数的影响

2．2 低蛋白氨基酸平衡日粮对仔猪营养物质表观消化率影响

2．3 低蛋白氨基酸平衡日粮对仔猪血清生化指标的影响

2．4 低蛋白氨基酸平衡日粮对仔猪血清氨基酸组成的影响

2．5 低蛋白氨基酸平衡日粮对仔猪回肠食糜游离氨基酸组成的影响

3 讨论

4 本章小结

参考文献

第六章 低蛋白氨基酸平衡日粮对仔猪血清代谢谱的影响

1 材料与方法

1．1 试验设计和样品采集

1．2 试剂与仪器

1．4 代谢组学数据分析

2 结果

2．1 低蛋白氨基酸平衡日粮对仔猪血清代谢物总离子流图的影响

2．2 低蛋白氨基酸平衡日粮对仔猪血清代谢物组成的影响

2．3 低蛋白氨基酸平衡日粮对仔猪血清中代谢物浓度的影响

2．4 低蛋白氨基酸平衡日粮对仔猪体内代谢途径的影响

2．5 低蛋白氨基酸平衡日粮对仔猪代谢标志物的影响

3 讨论

4 本章小结

参考文献

第七章 低蛋白氨基酸平衡日粮对仔猪肠道微生物及肠道上皮基因表达影响

1 材料和方法

1．1 材料

1．2 细菌DNA提取和荧光定量PCR

1．3 生物胺检测

1．4 酚和吲哚类物质检测

1．5 挥发性脂肪酸检测

1．6 食糜氨态氮浓度测定

1．7 RNA提取

1．8 总RNA反转录

1．9 荧光定量PCR

1．10 免疫球蛋白检测

1．11 数据处理与统计分析

2 结果

2．1 低蛋白氨基酸平衡日粮对仔猪食糜微生物区系的影响

2．2 低蛋白氨基酸平衡日粮对仔猪食糜中短链脂肪酸的影响

2．3 低蛋白氨基酸平衡日粮对仔猪食糜生物胺浓度的影响

2．4 低蛋白氨基酸平衡日粮对仔猪食糜氨氮浓度的影响

2．5 低蛋白氨基酸平衡日粮对仔猪食糜酚和吲哚类浓度的影响

2．6 低蛋白氨基酸平衡日粮对仔猪肠黏膜基因表达的影响

2．7 低蛋白氨基酸平衡日粮对仔猪肠黏膜免疫球蛋白表达的影响

3 讨论

4 本章小结

参考文献

全文结论

本文创新点

附录

致谢

攻读博士学位期间发表的论文