产酶溶杆菌OH11中Ⅳ型菌毛组装和调控基因的鉴定、互作及功能研究

摘要

产酶溶杆菌属于溶杆菌属，黄单胞科。与该科的其他成员不同，溶杆菌不是动植物病原细菌，而是一类具有生防潜力的环境友好型革兰氏阴性细菌。与其他成员相比，溶杆菌还有一个重要特征:细胞表面没有鞭毛，但具有依赖于Ⅳ型菌毛(TypeⅣpili，T4P)的蹭行运动(Twitching motility，TM)。 T4P是可弯曲的丝状物，主要由结构蛋白——菌毛蛋白PilA(Pilin)组成。T4P存在于革兰氏阴性和阳性细菌中，其功能涉及细菌的毒性、表面粘附能力、运动性、生物膜的形成和遗传物质摄取等。在溶杆菌的典型种——产酶溶杆菌中已有研究报道T4P介导的TM参与该菌对真菌菌丝的粘附和定殖，是该菌一种重要的生防机制。然而，关于产酶溶杆菌中T4P的组装和调控基因知之甚少。本研究以具有自主知识产权的产酶溶杆菌OH11菌株及其完整的基因组为对象，开展了T4P组装和调控基因的鉴定、互作和功能研究。本研究通过生物信息学预测、基因敲除、袁型鉴定和蛋白-蛋白互作等手段，鉴定了产酶溶杆菌中参与T4P形成的主要组装基因及重要调控基因，并明确了这些基因产物之间的互作情况，基本形成了产酶溶杆菌T4P的组装模型，为后续深入研究T4P在产酶溶杆菌中的生物学功能（如菌丝粘附等）奠定了重要的遗传学基础。主要研究结果如下: 1.通过生物信息学分析在产酶溶杆菌OH11基因组中发现了29个与T4P相关的pil基因，它们以8个基因簇的形式存在于基因组中。基因簇1和2的基因产物为T4P形成所需的minor pilin，预测定位在细胞的内膜上;基因簇3主要形成Pil-Chp系统，负责T4P的调控;基因簇4主要形成major pilin(PilA)以及相关的调控系统(PilS/PilR)等;基因簇5和8含有T4P拆卸调控基因pilT;基因簇6含有单个T4P主要major pilin(PilA2);基因簇7编码T4P组装的重要组份(PilMNOPQ)，其预测功能为在内膜和周质空间协助PilA的组装。 2.通过基因同源重组等手段，构建了29个pil基因的缺失突变株以及相应的互补菌株。以这些菌株为对象，通过多种表型检测，获得了如下发现: (1)菌落形态观察表明，△pilE1、△pilY1、△pilV1、△fimT、△pilG、△pilA、ΔpiIS、△pilR、△pilB、ΔpilC、△pilM、△pilN、△pilO、△pilP、△pilQ、△pilT、△pilT2这些突变体菌株的生长状态与野生型菌株OH11有显著差异，即它们的菌落四周湿润透亮，部分菌株形成了不规则的流动状态。而△pilV2、△pilW、△pilX2、△pILY2、△pilE2、△pilJ、△pilL、△pilH、△pilD、△pilT3、△pilA22这些突变体菌株的生长状态与野生型OH11相似。 (2)TM检测发现（TM形成的指示现象:菌落边缘有运动细胞），△pilV2、△pilW、△pilX2、△pilY2、△pilE2、△pilJ、△pilL、△pilH、△pilD、△pilT3、△pilA2这11个突变体菌株没有丧失TM能力，而△pilE1、△pilY1、△pilX1、△pilV1、△fimT、△pilG、△pilA、△pilR、△pilS、△pilB、△pilC、△pilM、△pilN、△pilO、△pilP、△pilQ、△pilT1、△pilT2这18个突变体菌株丧失了TM的形成能力，即菌落的边缘未见运动细胞，而相应的互补菌株则恢复了TM的形成能力（即互补菌株的菌落边缘可见清晰的运动细胞），表明产酶溶杆菌中18个pil基因参与了TM的形成。 (3)扫描电镜观察显示:野生型OH11菌体细胞表面形成了多根细长的T4P。在相同的电镜观察条件下，我们发现在18个TM丧失的pil突变株中，有16个突变株(△pilE1、△pilY1、△pilX1、△pilV1、△fimT、△pilB、△pilC、△pilM、△pilN、△pilO、△pilP、△pilQ、△pilA、△pilR、△pilS、△pilG)表面未检测到T4P，建立了T4P和TM之间的直接联系。与预期相符，作为T4P拆卸的调控基因pilT，我们发现△pilT1和△pilT2虽然丧失了TM，但细胞表面T4P的数量则显著增加（与WT相比）。这一结果揭示pilT缺失后，菌体细胞表面的T4P无法拆卸，形成更多的T4P，导致T4P介导的正常的TM发生混乱（丧失）。作为对照，3个TM未丧失的pil突变株仍然形成清晰可见的T4P。 (4)基因共转录研究显示:这些丧失TM的18个pil基因分布于4个基因簇。具体发现为:基因簇1中的pilE1到fimT基因形成一个operon，启动子位于fimT基因上游;基因簇4中的pilB到pilD基因形成operon，启动子位于pilB基因上游;基因簇7中的pilM到piIQ基因形成operon，启动子位于pilM基因上游;基因簇8中的pilT1到pilT2基因形成一个operon，启动子位于pilT1基因上游。 3.通过细菌双杂交技术，研究了负责TM的18个pil基因的互作情况，主要发现包括:(1)T4P核心组装蛋白PilA可以与绝大多数Pil蛋白互作，表明其他Pil蛋白参与了PilA形成T4P的组装过程;(2)多数minor pilin(PilE，PilY1，PilX1，PilV1和FimT)产物之间可以相互互作，并且它们均能与T4P内膜平台蛋白PilC互作，表明在产酶溶杆菌中PilC与minor pilins互作，共同形成T4P的内膜平台，帮助T4P核心蛋白PilA从内膜向胞外组装和延伸;(3)调控基因PilS（一个组氨酸激酶）可以与PilC和minor pilin互作，这是细菌中关于PilS感知胞内信号的新发现，揭示PilS可能需要与PilC或minor pilin互作才能发挥其调控功能;(4)PilT1、PilT2为T4P拆卸的ATPase，但它们之间可以相互作用，具体的机制未知。最后通过所有Pil蛋白的相互作用以及其他相关报道，我们提出了产酶溶杆菌中T4P的组装模型。这是黄单胞科细菌中第一个T4P的模型，为深入研究T4P与黄单胞科中病原细菌的致病性以及与溶杆菌的生防机制奠定了重要基础。

目录

声明

摘要

上篇文献综述

第一章产酶溶杆菌的研究进展

1产酶溶杆菌的分类及鉴定

2产酶溶杆菌的生物学特征

3产酶溶杆菌的生物防治功能及调控机理研究

第二章细菌Ⅳ型菌毛组装和功能的研究进展

1Ⅳ型菌毛的结构

2Ⅳ型菌毛的组装

3Ⅳ型菌毛的主要功能

下篇研究内容

第一章产酶溶杆菌OH11中Ⅳ型菌毛组装和调控基因的鉴定及功能研究

1试验材料

2试验方法

3结果与分析

4讨论

第二章Pil蛋白的相互作用研究

1试验材料

2试验方法

3结果分析

4讨论

参考文献

致谢