田菁根瘤菌中烷基氢过氧化物酶在抗氧化压力及共生固氮中的生理作用

摘要

根瘤菌与豆科植物能够共生形成根瘤进行固氮，在相互作用过程中植物会产生防御反应，会产生一部分活性氧物质ROS(reactive oxygen specie)来阻抗细菌的侵入。植物进行光合作用会使得体内氧化压力升高，根瘤菌为了在宿主体内定殖必须要适应植物体内氧化压力的变化，因此会产生一些过氧化物酶来进行代谢。此外共生固氮是厌氧反应，因此过氧化物酶的产生对根瘤菌与豆科植物的共生过程起到非常重要的作用。田菁固氮根瘤菌(Azorhizobium caulinodans ORS571)与宿主毛萼田菁既可以形成根瘤，同时又可以形成茎瘤。茎瘤完全暴露在空气中，且其皮层中含有能进行光合作用放氧的叶绿体，因此茎瘤中的类菌体更易受到活性氧物质的危害。因此研究A.caulinodans ORS571对过氧化物的抗性机制十分重要。
　　在根瘤菌中，过氧化氢酶可以清除共生过程中产生的ROS，并将过氧化氢转化成水和氧。在本研究中通过生物信息学分析确定了azc1050和azc1350分别编码A.caulinodans ORS571中烷基氢过氧化物酶(AhpC)和烷基氢过氧化物酶家族蛋白(Bcp)。首先利用同源重组的方法对这两个基因进行了框内缺失，在体外模拟体内环境进行了敏感性实验，实验中ahpC和bcp缺失株对有机氢过氧化物类的物质不是特别敏感，它们分别是异丙苯氢过氧化物(CuOOH)和叔丁基氢过氧化物(tBOOH)，但对过氧化氢(H2O2)表现出较强的敏感性。这表明在所研究的三种过氧化物中，aHpC、bcp对H2O2的清除能力强于有机氢过氧化物类。据报道，在大肠杆菌中，ahpC、bcp的缺失株对过氧化氢以及有机氢都表现出一定的敏感性。此外，在大部分细菌中，这整个过程都受到转录调控蛋白OxyR的调控，OxyR是属于LysR家族的调控蛋白。据了解oxyR可以激活或者抑制oxyR调节子的表达，包括ahpCF, katG，gorA，grxA，trxC,dps，并且在大肠杆菌Escherichia coli和铜绿假单胞菌 Pseudomonas aeruginosa中AhpC受到OxyR的正调控。于是构建了ahpC的翻译融合表达载体，发现基因oxyR缺失后对ahpC的表达量没有显著影响。且加入过氧化氢诱导两小时后再次测定lacZ活性，发现结果与不加过氧化氢时活性一致，即oxyR对ahpC没有调控关系，并且过氧化氢对其不起诱导作用。可以认为在田菁根瘤菌中ahpC是低水平的组成型表达。根据实验结果发现ahpC对有机氢过氧化物敏感，而ohr是细胞内特异性的清除有机氢过氧化物类的过氧化物酶，且能够被CuOOH诱导，因此本文还研究了两者在清除CuOOH功能上是否存在功能互补关系，结果证明ohr在缺失株ahpC中的表达量升高约1.5倍，CuOOH诱导后表达量升高2倍，因此两者在功能上着实有互补关系。
　　此外，本文还研究了ahpC和bcp对A.caulinodans ORS571与毛萼田菁结瘤以及共生固氮的影响。由于细菌在侵染豆科植物时，豆科植物的根部会发生根毛卷曲，因此我们进行了根毛吸附实验，研究结果表明ahpC和bcp的缺失菌株在根毛吸附能力上均与野生型菌株没有显著差异。通过种植毛萼田菁，对30d大小的茎瘤进行计数，发现在结瘤数目上，敲除株的茎瘤数明显少于野生型菌株，最后对茎瘤的瘤体进行了固氮酶活性的测定，同样敲除株的固氮酶活性均低于野生型菌株。从透射电镜实验观察侵染类菌体的情况，发现敲除株与野生型菌株没有差异。基于这些研究结果，ahpC和bcp不仅在抗氧化过程中起到非常重要的作用，在与宿主植物相互作用形成茎瘤以及共生固氮方面也起到重要的作用。

目录

声明

摘要

符号与缩略语说明

第一章 文献综述

1．1 根瘤菌简介

1．2 豆科植物与根瘤菌的结瘤固氮

2 田菁固氮根瘤菌与宿主毛萼田菁

2．1 田菁固氮根瘤菌

2．2 毛萼田菁

3 活性氧

3．1 ROS的产生与来源

3．2 ROS对细胞的毒害

4．1 过氧化物酶的分类

4．2 烷基氢过氧化物酶的结构和反应机制

4．3 烷基氢过氧化物酶的功能

5 ROS在共生中的作用

第二章 烷基氢过氧化物酶的抗氧化能力的研究

1 材料与方法

1．1 菌株与质粒

1．2 培养基与培养条件

1．3 试验的酶和试剂

1．4 基本实验方法

1．5 ahpC、bcp框内缺失菌株的构建

1．6 菌株生长曲线的测定

1．7 小滤纸片法检测各个突变株的生长

1．8 氧化压力下各个突变株生长曲线的测定

1．9 杀菌实验

1．10 ahpC、bcp回补菌株的构建

2 结果与分析

2．1 过氧化物酶缺失株的构建

2．2 过氧化物酶缺失株生长曲线

2．3 小滤纸片法检测高浓度氧化压力下缺失株的生长

2．4 氧化压力下缺失株的生长曲线

2．5 杀菌实验

2．6 回复突变菌株的构建

3 小结与讨论

第三章 烷基氢过氧化物酶功能的研究

1．1 菌株与质粒

1．2 培养基与培养条件

1．3 试验的酶和试剂

1．4 目的基因表达载体的构建

1．5 ahpC和oxyR调控关系的研究

1．6 过氧化氢酶(CAT)活性的测定

1．7 ahpC和ohr功能的研究

2 结果与分析

2．1 目的基因表达载体的构建

2．2 ahpC和oxyR调控关系的研究

2．4 ohr在WT和△ahpC中表达量的检测

3 小结与讨论

第四章 烷基氢过氧化物酶缺失株生理功能研究

1 材料与方法

1．1 实验菌株

1．2 培养基与培养条件

1．3 基本实验方法

1．4 根毛吸附实验

1．5 结瘤实验

1．6 透射电镜(TEM)

1．7 ahpC、bcp缺失株对nodA表达量的影响

1．8 固氮酶活性的测定

2 结果与分析

2．1 根毛吸附结果

2．2 结瘤实验

2．3 透射电镜结果

2．4 ahpC、bcp缺失株对nodA表达量的影响

2．5 固氮酶活性的测定

3 小结与讨论

全文总结

本文创新点

参考文献

附录

致谢