水稻漆酶介导植株体内阿特拉津和异丙隆降解机理的研究

摘要

漆酶是一类大的含铜多酚氧化酶，具有特异性的氧化还原位点，参与植物生长发育、调节植物对外源有毒物质如除草剂、重金属等环境胁迫响应具有重要的作用。阿特拉津(atrazine，ATR)是一种三嗪类选择性内吸传导型苗前、苗后除草剂，干扰抑制植物的光合作用，破坏叶绿素的合成，抑制碳水化合物的生成、碳源的还原和细胞中CO2的还原，从而导致杂草致死。异丙隆(isoproturon，IPU)是一种内吸传导型的取代脲类除草剂，通过干扰光合作用Ⅱ的电子传递，抑制光合作用而起到去除杂草的作用。
　　在本文研究中，对阿特拉津、异丙隆处理下水稻幼苗的转录组进行高通量测序，找出参与有毒除草剂阿特拉津、异丙隆解毒代谢的漆酶基因，经差异表达筛选得到2个阿特拉津胁迫下的漆酶基因和11个异丙隆胁迫下的漆酶基因，随机挑选其中5个漆酶基因进行验证和实时荧光定量PCR分析，其调控趋势与数字表达谱一致。运用生物信息学软件对水稻漆酶基因进行进化树构建和启动子顺式作用元件预测。
　　在0.4 mg·L-1的阿特拉津、2 mg·L-1异丙隆处理下，水稻幼苗叶片中叶绿素含量降低，茎叶和根中TBARS含量升高，电解质渗透率增大，表明阿特拉津、异丙隆对水稻产生毒性。水稻地上部分和地下部分漆酶活力较空白处理纽显著上升，表明了除草剂的处理会激发水稻幼苗自身的防御机制，分泌更多的漆酶来抵抗外界的不利影响。
　　为研究漆酶基因的功能，我们将水稻漆酶基因(LOC_Os12g15680和LOC_Os01g63190)成功转入毕赤酵母X-33细胞。重组酵母的漆酶活力提高，且重组酵母-LOC_Os12g15680发现积累更少的阿特拉津和产生更多阿特拉津的降解产物，阿特拉津的降解率提高了1.56倍;重组酵母-LOC_Os01g63190发现积累更少的异丙隆和产生更多异丙隆的降解产物，异丙隆的降解率提高了1.83倍。重组酵母对阿特拉津、异丙隆的代谢降解产物采用超高效液相色谱串联质谱（UPLC/MS/MS）检测技术鉴定与分析。检测出阿特拉津的主要代谢产物是羟基化阿特拉津HDHA，异丙隆的主要代谢产物是2-OH-isopropyl-IPU。
　　研究表明，水稻漆酶基因能在毕赤酵母中高效表达，而且具有较好的降解除草剂阿特拉津、异丙隆的能力，为今后培育阿特拉津、异丙隆的抗性植物在作物脱毒代谢加速降解有毒除草剂残留的研究方面提供依据。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一章 文献综述

1 漆酶的概况

1．1 漆酶的来源

1．2 漆酶的理化性质

1．3 漆酶的生理功能

1．4 漆酶的分子生物学研究进展

2 阿特拉津的简介

2．1 阿特拉津的基本性质

2．2 阿特拉津的应用概况和除草机理

2．3 阿特拉津对生态环境的污染

2．4 阿特拉津在环境中的降解代谢

3 异丙隆的简介

3．1 异丙隆的基本性质

3．2 异丙隆的应用概况和除草机理

3．3 异丙隆对环境的污染

3．4 异丙隆在环境中的降解代谢

4 本研究的目的及意义

5 本研究的内容

参考文献

第二章 水稻漆酶在阿特拉津、异丙隆诱导下的基因表达和生物信息学分析

1 材料

1．1 供试材料

1．2 试验试剂

2 实验方法

2．1 水稻种子的萌发及幼苗的培养和处理

2．2 样品的制备

2．3 进化树的构建

2．5 基因染色体定位

2．6 实时荧光定量PCR

3 结果与讨论

3．1 水稻漆酶基因的高通量测序数据评估

3．2 基因样品间公共和特有标签分析

3．3 进化树的构建

3．4 水稻漆酶基因的启动子顺式作用元件分析

3．5 水稻漆酶基因的染色体定位

3．6 RT-PCR对测序基因的验证

4 本章小结

参考文献

第三章 阿特拉津、异丙隆诱导下水稻幼苗的胁迫及水稻漆酶酶学应答

1 材料

1．1 供试材料

1．2 试验试剂

1．3 试验仪器

2 实验方法

2．1 水稻种子的萌发及幼苗的培养和处理

2．2 水稻幼苗叶片的叶绿素含量的测定

2．3 水稻幼苗组织中TBARS含量的测定

2．4 水稻幼苗组织中电解质渗透率的测定

2．5 水稻幼苗叶片中木质素含量的测定

2．6 水稻幼苗中漆酶活力的测定

3 结果与分析

3．1 阿特拉津、异丙隆对水稻幼苗叶片中叶绿素含量的影响

3．2 阿特拉津、异丙隆对水稻幼苗TBARS的影响

3．3 阿特拉津、异丙隆对水稻幼苗电解质渗透率的影响

3．4 阿特拉津、异丙隆对水稻幼苗叶片中木质素含量的影响

3．5 阿特拉津、异丙隆对水稻漆酶活力的影响

4 本章小结

参考文献

第四章 水稻漆酶基因的克隆与分析

1 材料

1．1 菌种与质粒

1．2 试验仪器

1．3 试验试剂

1．4 培养基

2 实验方法

2．1 水稻DNA的提取

2．2 目的基因的分离

2．3 目的基因的克隆及测序

2．4 漆酶基因在毕赤酵母中的异源表达

2．5 重组酵母对阿特拉津、异丙隆的抗性

2．6 漆酶活力的测定

2．7 重组毕赤酵母对阿特拉津、异丙隆的降解及其降解产物分析

3 结果与分析

3．1 目的基因的分离

3．2 质粒DNA的提取与酶切鉴定

3．4 毕赤酵母X-33阳性转化子的验证

3．5 漆酶基因在重组毕赤酵母中的诱导表达

3．6 重组酵母对阿特拉津、异丙隆的抗性

3．7 重组漆酶活力的测定

3．8 YPD培养基的添加回收

3．9 重组毕赤酵母对阿特拉津、异丙隆的降解

3．10 阿特拉津、异丙隆及其主要代谢产物的鉴定

4 本章小结

参考文献

全文总结

论文创新点

论文不足之处

攻读硕士学位期间发表的学术论文目录

致谢