灰飞虱ABC转运蛋白基因的鉴定及其抗药性功能研究

摘要

ABC转运蛋白（ATP-binding cassette transporter，三磷酸腺苷结合盒转运蛋白）超家族作为最大跨膜蛋白家族，广泛存在于从细菌到人在内的所有生物体中。在真核生物中，第一个ABC转运蛋白，P蛋白(p-gp，ABCB1)是在人类肿瘤细胞中发现的，并参与人体肿瘤细胞的多药抗性(multidrug resistance，MDR)。随着ABC转运蛋白的深入研究，体外体内实验证实多抗蛋白基因可以介导多种结构不相关药物的转运，因此ABC转运蛋白介导的昆虫抗药性机制也引起了广泛研究。ABC转运蛋白被认为是继细胞色素P450、羧酸酯酶、谷胱甘肽-S-转移酶之外参与内外源物质解毒作用的重要蛋白家族，在不同种类杀虫剂的转运或抗性形成过程中发挥重要作用。 灰飞虱Laodelphax striatellus(Fallén)属于半翅目、飞虱科，是中国一种重要的农业害虫。由于过度依赖化学防治而导致抗药性的产生，已成为灰飞虱治理的关键问题。本实验室前期工作获得了灰飞虱对毒死蜱、溴氰菊酯和吡虫啉的抗性品系以及敏感品系，并对传统的代谢酶参与的抗性机制进行了探索。本研究以灰飞虱转录组搜索并克隆的ABC转运蛋白基因作为研究对象，利用已有的抗性品系筛选与毒死蜱、溴氰菊酯和吡虫啉抗性相关的ABC转运蛋白基因。通过定量PCR分析三种不同抗性品系灰飞虱中ABC转运蛋白的组成型和诱导型过表达情况，并结合维拉帕米增效实验，意在揭示灰飞虱中ABC转运蛋白介导的对多种药剂的抗性机理。该研究结果从新的杀虫剂代谢途径的角度揭示了灰飞虱复杂的抗性机制，为交互抗性的形成提供了新的解释，也为制定更加合理的农药使用规范以及更有效的抗性治理策略提供理论依据。 1.灰飞虱ABC转运蛋白的克隆和分析 通过灰飞虱转录组数据库搜索，GeneDOC比对去除冗余，获得序列长度大于200bp的99条ABC转运蛋白片段。利用NCBI数据库进行序列比对显示，这些序列与其他的昆虫种有高度的相似性，属于ABC转运蛋白基因家族。采用RT-PCR和RACE技术对搜索到的片段进行克隆和验证，利用ContigExpress软件对克隆得到的序列进行拼接去冗余后，最终获得40条具有全长序列的ABC转运蛋白基因，完整开放阅读框的大小范围为603aa到2221aa。利用Pfam搜索到的保守的核苷酸结合域构建进化树，结果表明与其他已报道的昆虫一致，灰飞虱ABC转运蛋白超家族也被划分为ABCA-H八个亚家族，其中包括2个ABCAs，6个ABCBs，5个ABCCs，2个ABCDs，1个ABCE，2个ABCFs，14个ABCGs和8个ABCHs。ABC全转运子共有9个，主要存在于ABCA、ABCB和ABCC亚家族，而70％的基因是半转运子，主要存在于ABCB、ABCD、ABCG和ABCH亚家族中。分析已在转录组或基因组水平上完整注释并报道的昆虫ABC转运蛋白基因的数据，可知ABC转运蛋白的数量在不同的昆虫物种中变化较大，从蜜蜂基因组中鉴定的41个到赤拟谷盗基因组中鉴定的73个不等。本研究克隆的基因覆盖昆虫ABC转运蛋白的所有亚家族，数量上接近蜜蜂基因组中鉴定的数量，而且在不同昆虫中数量保守的亚家族中，克隆获得的基因数量与其他昆虫的相同，表明灰飞虱的大部分ABC转运蛋白基因已被鉴定出来，为进一步研究灰飞虱ABC转运蛋白的功能及与抗药性的关系奠定了基础。 2.毒死蜱抗性相关的灰飞虱ABC转运蛋白基因分析 解毒代谢作用增强是灰飞虱毒死蜱抗性的重要机制，而ABC转运蛋白基因作为一类参与细胞解毒代谢的重要转运蛋白，可能涉及灰飞虱对毒死蜱的解毒代谢过程。本章通过活体增效试验测定了ABC转运蛋白抑制剂—维拉帕米在毒死蜱抗性品系JH-chl及敏感品系JH-sus中对毒死蜱的增效作用，结果表明维拉帕米在JH-chl品系中对毒死蜱增效显著，增效比为3.02倍，而在JH-sus品系中却无增效作用。以JH-sus品系为对照分析已克隆得到的40个ABC转运蛋白基因在转录水平的表达情况发现，JH-chl抗性品系的雌成虫和4龄若虫的ABC转运蛋白基因分别有9个和25个出现显著的组成型过表达（表达量上升显著且超过2倍），没有发现类似的下调基因。该结果表明抗性品系中ABC转运蛋白的过量表达对其抗药性提高有明显的作用。利用毒死蜱LD25剂量对JH-chl品系雌成虫进行诱导试验发现，与丙酮处理的对照相比，JH-chl抗性品系中有13个ABC转运蛋白基因出现显著的诱导型过表达，其中12个为组成型过表达基因，表明这些基因可能参与毒死蜱的转运代谢。综上结果，本研究共发现有来自于ABCA/B/C/D/F/G/H七个亚家族的28个ABC转运蛋白基因在抗性品系中出现组成型或诱导型过表达的现象，其中7个基因在不同检测情况下均出现显著过表达，分别为LsABCB2、LsABCC4、LsABCD1、LsABCF1、LsABCG2、LsABCG6和LsABCG11。这些结果说明ABC转运蛋白家族的多个基因参与了灰飞虱对毒死蜱的代谢和抗性形成。 3.溴氰菊酯抗性相关的灰飞虱ABC转运蛋白基因分析 解毒代谢作用增强也是灰飞虱溴氰菊酯抗性的重要机制，而ABC转运蛋白基因已在多个昆虫物种中发现涉及拟除虫菊酯类杀虫剂的转运以及抗药性机制。本章通过活体增效试验测定了ABC转运蛋白抑制剂—维拉帕米在溴氰菊酯抗性品系JH-del及敏感品系JH-sus中对β-氯氰菊酯的增效作用，结果表明维拉帕米在JH-del品系中对β-氯氰菊酯增效显著，增效比为2.24倍，而在JH-sus品系中却无增效作用。以JH-sus品系为对照分析已克隆得到的40个ABC转运蛋白基因在转录水平的表达情况发现，JH-del品系的雌成虫和4龄若虫的ABC转运蛋白基因分别有13个和26个出现显著的组成型过表达（表达量上升显著且超过2倍），没有发现类似的下调基因。该结果表明抗性品系中ABC转运蛋白的过量表达对其抗药性提高有明显的作用。利用β-氯氰菊酯LD25剂量对JH-del品系雌成虫进行诱导试验发现，与丙酮处理的对照相比，JH-del抗性品系中有6个ABC转运蛋白基因出现诱导型过表达，且这6个基因均为组成型过表达基因，表明这些基因可能参与β-氯氰菊酯的转运代谢。综上结果，本研究共发现有来自于所有ABC转运蛋白亚家族ABCA-H的28个ABC转运蛋白基因在抗性品系中出现组成型或诱导型过表达的现象，其中5个基因在不同检测情况下均出现显著过表达，分别为LsABCB2、LsABCC4、LsABCG2、LsABCG6和LsABCG7。这些结果说明ABC转运蛋白家族的多个基因参与了灰飞虱对拟除虫菊酯类杀虫剂（溴氰菊酯和β-氯氰菊酯）的代谢和抗性形成。 4.吡虫啉抗性相关的灰飞虱ABC转运蛋白基因分析 新烟碱类杀虫剂吡虫啉作为重要的杀虫剂类型被广泛用于稻田飞虱的防治。灰飞虱田间种群对吡虫啉的抗性早有报道。解毒代谢作用增强是灰飞虱吡虫啉抗性的重要机制，而ABC转运蛋白基因作为一类参与细胞解毒代谢的重要转运蛋白，可能涉及灰飞虱对吡虫啉的解毒代谢过程。本章通过活体增效试验测定了ABC转运蛋白抑制剂—维拉帕米在吡虫啉抗性品系JH-imi及敏感品系JH-sus中对吡虫啉的增效作用，结果表明维拉帕米在JH-imi品系中对吡虫啉增效显著，增效比为1.52倍，而在JH-sus品系中却无增效作用。以JH-sus品系为对照分析已克隆得到的40个ABC转运蛋白基因在转录水平的表达情况发现，JH-imi抗性品系的雌成虫和4龄若虫的ABC转运蛋白基因分别有11个和8个出现显著的组成型过表达（表达量上升显著且超过2倍），没有发现类似的下调基因。该结果表明抗性品系中ABC转运蛋白的过量表达对其抗药性提高有明显的作用。利用吡虫啉LD25剂量对JH-imi品系雌成虫进行诱导试验发现，与丙酮处理的对照相比，JH-imi抗性品系中没有ABC转运蛋白基因出现诱导型过表达。综上结果，本研究共发现有来自于ABCB/C/D/G/H五个亚家族的17个ABC转运蛋白基因在抗性品系中出现组成型或诱导型过表达的现象，其中只有2个基因在成虫和幼虫期均出现显著过表达，分别为LsABCG10和LsABCH4。这些结果表明ABC转运蛋白家族的多个基因参与了灰飞虱对吡虫啉抗性形成。 5.灰飞虱候选多抗蛋白基因的分析 作为解毒代谢过程中的重要蛋白，上述结果表明灰飞虱ABC转运蛋白基因参与了多种不同类型的杀虫剂的代谢和抗性形成，如毒死蜱、溴氰菊酯（β-氯氰菊酯）以及吡虫啉。多数ABC转运蛋白基因在不同虫龄阶段或药剂处理下，出现转录水平过表达，其中8个ABC转运蛋白在三个抗性品系成虫期均出现显著的组成型过表达，推测这些ABC转运蛋白基因可能作为灰飞虱候选多抗蛋白基因在多种药剂的抗性或转运过程中发挥重要作用。对8个候选多抗蛋白基因的基因组水平上基因拷贝数进行分析，采用JH-sus品系作为对照，发现LsABCG10在JH-chl、JH-del以及JH-imi品系中基因组拷贝数出现3、2和2倍的扩增现象，而其他7个基因拷贝数无变化。这些结果说明灰飞虱多抗药相关的ABC转运蛋白的过表达多数由于转录水平增强所引起，且脑可能是候选多抗蛋白基因参与多药抗性的重要器官。

目录

声明

摘要

第一章文献综述

1 ABC转运蛋白及多抗药性

1．1 ABC转运蛋白的分子结构

1．2 ABC转运蛋白的作用机制

1．3 ABC转运蛋白分类及生理功能

2 ABC转运蛋白与抗药性关系的研究

2．1人类多抗蛋白的研究现状

2．2昆虫多抗蛋白的研究现状

2．3 ABC转运蛋白的研究技术

3灰飞虱的抗药性研究现状

3．1灰飞虱的发生及危害

3．2灰飞虱的防治及抗药性的发生

3．3灰飞虱的交互抗性

3．4灰飞虱抗性机理及分子机制研究

4本研究的目的和意义

第二章灰飞虱ABC转运蛋白的克隆和分析

1．材料和方法

1．1 供试昆虫

1．2试虫饲养

1．3主要试剂和仪器

1．4 ABC转运蛋白基因的克隆与鉴定

2 结果

2．1 灰飞虱ABC转运蛋白基因的克隆和命名

2．2灰飞虱ABC转运蛋白基因的亚家族分类

2．3灰飞虱ABC转运蛋白的结构分析

3．讨论

第三章毒死蜱抗性相关的灰飞虱ABC转运蛋白基因分析

1．材料和方法

1．1 供试昆虫

1．2试虫饲养

1．3供试药剂

1．4主要试剂和仪器

1．5抗性再筛选方法

1．6维拉帕米增效和室内毒力测定方法

1．7生测统计分析方法

1．8毒死蜱抗性品系ABC转运蛋白组成型表达分析

1．9毒死蜱抗性品系ABC转运蛋白诱导型表达分析

1．10荧光实时定量PCR

2结果

2．1增效剂试验

2．2 ABC转运蛋白在JH-chl品系成虫中的组成型过表达

2．3 ABC转运蛋白在JH-chl品系若虫中的组成型过表达

2．4 ABC转运蛋白在JH-chl品系中的诱导型过表达

2．5与毒死蜱抗性相关的ABC转运蛋白

3．讨论

第四章溴氰菊酯抗性相关的灰飞虱ABC转运蛋白基因分析

1．材料和方法

1．1供试昆虫

1．2试虫饲养

1．3供试药剂

1．4主要试剂和仪器

1．5抗性再筛选方法

1．6维拉帕米增效和室内毒力测定方法

1．7生测统计分析方法

1．8溴氰菊酯抗性品系ABC转运蛋白组成型表达分析

1．9溴氰菊酯抗性品系ABC转运蛋白诱导型表达分析

1．10荧光实时定量PCR

2结果

2．1增效剂试验

2．2 ABC转运蛋白在JH-del品系成虫中的组成型过表达

2．3ABC转运蛋白在JH-del品系若虫中的组成型过表达

2．4 ABC转运蛋白在JH-del品系中的诱导型过表达

2．5与拟除虫菊酯类(溴氰菊酯和β-氯氰菊酯)抗性相关的ABC转运蛋白

3．讨论

第五章吡虫啉抗-性相关的灰飞虱ABC转运蛋白基因分析

1．材料和方法

1．1 供试昆虫

1．2试虫饲养

1．3供试药剂

1．4主要试剂和仪器

1．5抗性再筛选方法

1．6维拉帕米增效和室内毒力测定方法

1．7生测统计分析方法

1．8吡虫啉抗性品系ABC转运蛋白组成型表达分析

1．9吡虫啉抗性品系ABC转运蛋白诱导型表达分析

1．10荧光实时定量PCR

2结果

2．1增效剂试验

2．2 ABC转运蛋白在JH-imi品系成虫中的组成型过表达

2．3 ABC转运蛋白在JH-imi品系若虫中的组成型过表达

2．4 ABC转运蛋白在JH-imi品系中的诱导型过表达

2．5与吡虫啉抗性相关的ABC转运蛋白

3．讨论

第六章灰飞虱候选多抗蛋白基因的分析

1．材料和方法

1．1 供试昆虫

1．2试虫饲养

1．3主要试剂和仪器

1．4灰飞虱DNA的提取、纯化及鉴定

1．5总RNA提取和cDNA第一链的合成

1．6荧光实时定量PCR

2结果

2．1灰飞虱候选多抗蛋白基因的鉴定

2．2候选多抗蛋白基因的基因组拷贝数分析

2．3候选多抗蛋白基因在成虫期不同部位的表达分析

2．3候选多抗蛋白基因在不同发育阶段的表达分析

3 讨论

第七章全转运子LsABCC4的分析及外源表达初探

1．材料和方法

1．1供试昆虫

1．2试虫饲养

1．3主要试剂和仪器

1．4 全转运子LsABCC4开放阅读框的克隆验证与分析

1．5 LsABCC4真核表达载体的构建

1．6重组杆状病毒质粒的构建

1．7重组杆状病毒在Sf9细胞中的表达与检测

2．结果

2．1全转运子LsABCC4开放阅读框的克隆验证与分析

2．2全转运子LsABCC4的真核表达初探

3讨论

全文总结

参考文献

附录

攻读博士学位期间发表的学术论文

致谢