TGEV和PEDV重组猪痘病毒活载体疫苗的效力及载体生物安全评价

摘要

猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)和猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）是引起猪病毒性腹泻的两种主要病原，猪病毒性腹泻病从2010年起我国各地猪场呈现爆发流行，对养猪业造成巨大的经济损失。10日龄以内仔猪只要被感染，发病率为100％，死亡率极高。然而，现有的商品化疫苗不能有效的预防上述两种疫病。猪痘病毒（Swinepox virus，SPV）是痘病毒家族成员之一，目前市场上并没有商品化的猪痘活载体疫苗，是一种具有开发应用前景的活疫苗载体。本研究旨在研发TGEV和PEDV新型重组猪痘病毒活载体疫苗，并对载体减毒致弱和生物安全性评价。 1.表达猪传染性胃肠炎截短的S蛋白的重组猪痘病毒的构建及免疫评价 猪传染性胃肠炎病毒是一种冠状病毒，可以感染各年龄段猪，但是对哺乳期的新生仔猪最为敏感，死亡率高达100％。本研究成功构建了表达猪传染性胃肠炎病毒保护性抗原S基因A位点的猪痘病毒活载体疫苗，希望能够用于防控猪传染性胃肠炎。免疫接种小鼠和猪动物模型后，进行体液免疫和细胞免疫水平检测。结果表明TGEV特异性抗体水平显著升高，细胞免疫中Th1型和Th2型细胞因子水平均有升高，中和抗体水平显著升高。新生仔猪被动免疫保护实验结果显示，重组活载体疫苗rSPV-SA对新生仔猪保护率可达100％，未出现腹泻等临床病症。这些结果表明，重组猪痘病毒活载体疫苗rSPV-SA对TGEV强毒株的攻击具有较好的免疫保护效果。 2.表达猪流行性腹泻的S1蛋白的重组猪痘病毒的构建及免疫评价 猪流行性腹泻病毒(PEDV)是一种严重造成养殖猪场经济损失的病原。尽管市场有商业化疫苗进行销售，但是市场应用推广并不好，猪场临床反映，现有的商品化PEDV疫苗效果不佳。本研究构建了重组猪痘病毒rSPV-Sa株，该重组病毒成功的表达了PEDV(SQ2014株)截短的S蛋白，通过免疫原性评测显示，该rSPV-Sa能够有效激活机体IgA产生，IgG和细胞因子水平的提高。在接种猪第42天时，血清中中和抗体效价可以达到1∶24，而IgA水平高于灭活疫苗。在PEDV同源新型株(SQ2014)和异源传统毒株(CV777)的被动免疫攻毒保护实验中，我们发现rSPV-Sa组血清可以使机体抵抗同源SQ2014株的感染，有效保护率可达100％。而进行异源株(CV777)的攻毒实验中结果显示，rSPV-Sa被动免疫组不能抵抗CV777株的感染。我们通过对两株毒株的中和表位氨基酸进行比对发现，在中和表位附近两株毒株发生了较大的变化。数据结果表明重组的猪痘病毒或有望成为新型PEDV毒株的疫苗。 3.PEDV和TGEV二联重组猪痘病毒活载体疫苗的构建及免疫评价 猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和流行性腹泻病毒(PEDV)是两种临床常见的造成新生猪腹泻病原，严重危害猪场经济效益。尽管市场上有商品化二联灭活疫苗进行销售，但是推广应用的效果并不好。本研究首次构建了包含TGEV和PEDV两种病毒中和表位的重组猪痘病毒rSPV-TP株。通过BALB/C小鼠模型进行疫苗的免疫原性评价，结果显示rSPV-TP能够有效刺激机体产生有效的体液免疫和细胞免疫，对小鼠进行免疫后，TGEV和PEDV的IgG抗体水平显著升高，TH1和TH2型细胞因子均高于对照组，在小鼠接种疫苗后第42日时能够产生1∶600抗TGEV中和抗体效价和1∶30抗PEDV中和抗体效价。研究结果表明，重组的猪痘病毒rSPV-TP是一种具有潜力的TGEV和PEDV疫苗候选。 4.猪痘病毒的减毒致弱及生物安全性评估 猪痘病毒是痘病毒家族成员之一，具有许多痘病毒载体共有的优点，是一种具有开发应用前景的活载体疫苗，目前市场上并没有商品化的猪痘活载体疫苗进行临床应用。为了获得更加安全、有效的猪痘病毒活载体疫苗，本研究通过基因敲除技术成功构建了三株猪痘病毒基因缺失减毒优化株，△003、△010和△TK基因缺失株。通过不同宿主来源的十种细胞系进行病毒增殖复制能力评估，结果表明，基因敲除后的三株病毒在不同细胞上的复制能力均有下降，其中003和TK基因缺失株复制能力出现显著下降。免疫三种不同品系小鼠和新西兰大白兔实验结果表明，野生株和缺失株猪痘病毒均不会对小鼠和兔造成皮肤炎症。小鼠腹腔攻毒实验结果显示野生株和缺失株猪疸病毒均不会造成死亡，也未见出现任何临床病症。野生组和缺失组猪痘病毒在新西兰大白兔的注射部位60h失去感染活性活性。对40只一月龄仔猪进行安全性评价实验，结果显示，野生型SPV会导致猪皮肤在注射部位产生明显的痘疹。003基因和TK基因缺失组皮肤炎症完全消失。010基因缺失组病毒在高浓度时会引起猪产生痘疹，低浓度是痘疹减轻。通过对接种猪的血液进行病毒载量检测，发现血液中均未检出猪痘病毒。比较细胞免疫和体液免疫水平结果显示，缺失株相比野生型SPV诱导机体细胞免疫和体液免疫水平差异不大。研究表明减毒后的△003和△TK组或有望运用成一种安全的活载体兽用疫苗。 综上所述，本研究成功构建了TGEV、PEDV重组猪痘病毒活载体疫苗，该疫苗能够诱导免疫动物产生强烈的细胞免疫反应以及体液免疫反应，对上述两种病具有良好的预防效果。此外，减毒致弱后的猪痘病毒活疫苗载体具有更高的生物安全性，有望成为一种安全高效的新型动物疫苗。

目录

声明

摘要

英文缩写词表

第一章猪痘病毒及其作为载体的应用

1猪痘流行病学

2猪痘病毒分子特性

3 SPV毒力相关蛋白及其功能

3．1胸腺嘧啶核苷激酶

3．2核苷酸还原酶

4 SPV活疫苗载体的特性

5 SPV载体疫苗的应用发展

6展望

参考文献

第二章猪流行性腹泻病的研究进展

1．流行性腹泻流行病学

2．PEDV的分子特性

2．1 PEDV基因组

2．2PEDV蛋自

3．PEDV的疫苗研究

3．1灭活疫苗和弱毒疫苗

3．2基因工程疫苗

4．展望

参考文献

第三章猪传染性胃肠炎疫苗的研究进展

1 TGEV的临床特性

2 TGEV分子特性

2．1 TGEV基因组

2．2TGEV的四种结构蛋白

3 TGEV疫苗研究现状

3．1 TGEV传统疫苗

3．2基因工程疫苗

参考文献

第四章表达猪传染性胃肠炎病毒S蛋白A位点的重组猪痘病毒的构建及免疫评价

1材料与方法

1．1质粒、细胞和病毒

1．2方法

2结果

2．1猪传染性胃肠炎病毒S基因A位点PCR扩增结果

2．2重组猪痘病毒在模型小鼠免疫应答反应

2．3重组猪痘病毒rSPV-SA的生物安全性

2．4重组猪痘病毒在猪模型免疫应答反应

2．5新生仔猪被动免疫保护

2．6仔猪剖检组织病理学观察

3讨论

参考文献

第五章表达猪流行性腹泻病毒截短S1的重组猪痘病毒的构建及免疫评价

1材料与方法

1．1细胞和病毒

1．2表达PEDV的截短S蛋白的重组猪痘病毒

1．3重组SPV-Sa的PCR分析

1．4间接免疫荧光

1．6动物实验

1．7间接ELISA抗体滴度测定

1．8细胞因子检测

1．9中和抗体检测

1．10统计学分析

2结果

2．1重组猪痘病毒rSPV-Sa的鉴定

2．2重组猪痘病毒的安全性评估

2．3重组猪痘病毒体液免疫和细胞免疫反应

2．4新生仔猪攻毒实验评测

3．讨论

参考文献

第六章PEDV和TGEV二联重组猪痘病毒活载体疫苗的免疫评价

1材料与方法

1．1试验材料

1．2重组猪痘病毒转移载体构建

1．3重组猪痘病毒rSPV-TP的构建

1．4重组病毒rSPV-TP的鉴定

2．结果

2．1重组猪痘病毒rSPV-TP分子生物特性鉴定

2．2重组猪痘病毒的生物安全性

2．3重组猪痘病毒rSPV-TP在小鼠模型的免疫应答反应

3讨论

参考文献

第七章猪痘病毒活疫苗载体减毒及生物安全性评价

1材料与方法

1．1细胞与病毒

1．2载体构建

1．3缺失病毒的构建与纯化

1．4基因缺失猪痘病毒体外增殖能力

1．5遗传稳定性实验

1．6动物安全性实验评价

1．7间接ELISA抗体滴度测定

1．8细胞因子检测

1．9中和抗体检测

1．10统计学分析

2结果

2．1缺失的猪痘病毒生物学特性

2．2缺失猪痘病毒在不同宿主细胞系中的遗传稳定性

2．3小鼠模型评价

2．4兔动物模型评价

2．5猪模型评价结果

3讨论

参考文献

全文总结

致谢

攻读博士学位期间发表的论文