山药多糖PLGA纳米粒的制备及其免疫增强作用的研究

摘要

山药(Rhizoma discorea)，也称山蓣、麻山药、白苕、土薯等。现代药理学研究表明，山药中主要的活性成分为山药多糖(Chinese yam polysaccharide，CYP)，具有增强免疫、降血糖、降血脂、抗氧化、抗衰老、抗突变、抗肿瘤、调节肠道微生态、保肝护肝、促进生长、激活信号转导等作用。但山药多糖属于大分子多糖，若直接给药，则存在着多糖在体内代谢较快，作用时间短，作用范围不集中，用药量大以及生物利用度低等局限之处。从而限制了山药多糖临床应用的发展。因此，为拓展山药多糖在临床上的应用，新剂型的开发显得尤为重要。聚乳酸-羟基乙酸共聚物(Poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA)是一种人工合成的高分子共聚物，其具有良好的生物相容性、良好的生物可降解性、安全无毒以及无特异性免疫原性等特点，将其作为纳米材料制备成载药纳米微粒对药物具有缓释作用和靶向效应，保护药物的生物活性，大幅提高了药物的生物利用度，降低药物的毒副作用等优点，引发研究者们的广泛关注和探宄。将山药多糖包封于PLGA纳米粒制备成注射剂，可避免CYP在体内半衰期短的缺点，降低CYP的用量，同时还能提高机体对CYP的吸收，延长药物作用时间，提高CYP的生物利用度，提高CYP的免疫增强活性等。本试验选取双重乳化-溶剂挥发法制备山药多糖PLGA纳米粒（Chinese yam polysaccharide PLGA nanoparticles，CYPP），运用响应面法优化了CYPP的制备条件，测定了纳米粒的表征并通过体内与体外试验系统地研究了CYPP的免疫增强活性。试验分为以下四个部分: 试验Ⅰ山药多糖PLGA纳米粒制备条件的优化。采用双重乳化-溶剂挥发法制备了山药多糖PLGA纳米粒，并运用响应面法优选出山药多糖PLGA纳米粒的最佳制备条件。以微柱离心法将包封有山药多糖的PLGA与未包封的山药多糖分离，用苯酚-浓硫酸法测定山药多糖的浓度，并计算纳米粒的包封率。将CYPP的包封率和载药量作为衡量纳米粒的指标，考察了内水相与油相的体积比、初乳与外水相的体积比、F68的浓度、PLGA的浓度等4个单因素对制备CYPP的影响。结果表明，内水相与油相的体积比、初乳与外水相的体积比以及F68的浓度等3个单因素对制备CYPP的影响较大。以单因素试验结果为基础，采用响应面分析法探究这3个因素在制备纳米粒的过程中的两两作用。分析试验结果，并作出调整后可得到CYPP的最优制备条件组合为:内水相与油相的体积比为1∶9，初乳与外水相的体积比为1∶10，F68的浓度为0.7％。验证最佳制备条件下制备的纳米粒的包封率，可知包封率为65.56±0.23％，与预测值66.82％相差较少。以最佳条件制备出的纳米粒，于透射电子显微镜及扫描电子显微镜下观察其超微形态和立体形态，可见纳米粒近似球体，形状大小均一，表面光滑致密，测得粒径为212.3±3.3nm，PDI值为0.121±0.013，小于0.3，说明纳米粒分布均匀，大小均一，形态稳定，分散性较好，由电势为负，表明纳米粒带负电荷。体外释放结果表明，在48h时，CYPP的累计释放百分率明显低于游离的CYP，说明CYPP释放CYP的速度明显慢于游离的CYP。 试验Ⅱ山药多糖PLGA纳米粒体外对小鼠脾脏淋巴细胞增殖的影响。采用MTT法测定淋巴细胞增殖，采用流式细胞术进行淋巴细胞的分型比较。首先对CYP和CYPP进行小鼠脾脏淋巴细胞生长的最大安全浓度测定。CYP和CYPP由0.8mg·mL-1为起始浓度倍比稀释至11个浓度与脾脏细胞共同培养，体外培养44h后使用MTT法在波长为570nm处测定吸光值，筛选出最大安全浓度;选取CYP、CYPP和BP的最大安全浓度及其以下的5个浓度，进行单独或者协同LPS作用于小鼠脾脏淋巴细胞，培养44h后以MTT法对淋巴细胞的增殖情况进行测定，以探究CYP和CYPP对B淋巴细胞增殖作用的影响。选取CYP、CYPP和BP的最大安全浓度及其以下的5个浓度，进行单独或者协同PHA作用于脾脏淋巴细胞，观察CYP和CYPP对T淋巴细胞增殖情况的影响。结果表明，CYPP的最大安全浓度为400μg·mL-1高于CYP的安全浓度200μg·mL-1;当CYPP浓度为200μg·mL-1时，CYPP单独或者协同LPS或PHA对小鼠脾脏淋巴细胞增殖的刺激效果最好，且均显著高于CYP组、BP组和细胞对照组;在浓度范围为25-200μg·mL-1时，CYP、CYPP和BP均能有效刺激淋巴细胞增殖，且CYPP对淋巴细胞增殖的刺激显著优于CYP组和BP组;CYPP的CD4+与CD8+的比值明显高于游离的CYP以及BP，说明CYPP比游离CYP和BP对T细胞的免疫分型更为有效。 试验Ⅲ山药多糖PLGA纳米粒体外对树突状细胞免疫功能的影响。为了考察山药多糖PLGA纳米粒对小鼠骨髓来源树突状细胞免疫功能的影响。首先运用激光共聚焦扫描显微镜探究了树突状细胞的摄取能力，为验证细胞周围的绿色荧光是来自细胞内的被标记药物，继而运用透射电子显微镜对细胞超微结构进行观察，直接观察树突状细胞对纳米粒摄取情况，这两项检测结果均表明，CYPP对树突状细胞的摄取能力影响大于单独的CYP和BP，且验证了树突状细胞已将纳米粒摄取入胞。流式细胞仪检测了树突状细胞在三种药物的刺激下，其表面MHCⅡ类分子以及共刺激分子CD80和CD86的表达水平变化，由结果可知，树突状细胞在CYPP的刺激下，其表面MHCⅡ类分子以及共刺激分子CD80和CD86的表达水平均显著高于单独的CYP组、BP组以及细胞对照组，结果说明经PLGA纳米粒包裹的CYP对树突状细胞的刺激作用、摄取作用以及成熟作用均强于单独的CYP和空白纳米粒，即CYPP对特异性免疫和非特异性免疫均可有效发挥其功能。 试验Ⅳ山药多糖PLGA纳米粒对卵清白蛋白抗原的免疫佐剂活性。为了探究山药多糖PLGA纳米粒作为OVA模式抗原的佐剂活性效果，以进一步验证山药多糖PLGA纳米粒这种新型佐剂的免疫调节效果。将6周龄的144只Balb/c小鼠随机分为6组，每组24只，以不同组分的OVA抗原疫苗皮下注射对小鼠进行首次免疫，7天后进行二免。在首次免疫24h后，采取小鼠的淋巴结，检测其中树突状细胞的活化状况。于首免后第14、21、28、35和42天采血，分离血清，采用ELISA试剂盒检测血清中OVA特异性IgG、总IgG、IgG2a和IgG1的抗体效价，同时无菌分离小鼠脾脏，收集脾脏淋巴细胞并进行培养，66-68h后采用MTT法测定淋巴细胞增殖情况;分离收集脾脏淋巴细胞培养上清并以ELISA试剂盒测定血清中细胞因子IL-4、IL-6、IFN-γ和IL-2的含量。完整采取小鼠脾脏，制作组织切片，并观察脾脏组织学变化。结果表明，CYPP作为佐剂包封OVA抗原型疫苗免疫小鼠后，淋巴结中的树突状细胞活化程度均高于其他组;CYPP/OVA组在免疫后的各个时间段的抗体水平均显著高于CYP/OVA组和BP/OVA组;促进T、B淋巴细胞增殖以及促进细胞因子的分泌，调节免疫作用;促使脾小结增多，白髓动脉周围淋巴鞘增犀等组织学变化，增强免疫功能。结果表明，PLGA纳米粒能显著提高CYP对特异性免疫增强的药效，延长药物作用时间等达到保护和增强抗原的免疫效果和缓释等目的。

目录

声明

论文说明

摘要

符号及缩略语

绪论

第一章文献综述

1 山药多糖的研究进展

1．1 山药多糖的理化性质和结构研究

1．2山药多糖的药理作用

1．3 山药多糖的应用现状与开发

2 PLGA纳米粒

2．1 PLGA的合成和特点

2．2 PLGA纳米粒的制备方法

2．3 PLGA纳米粒的应用

2．4 PLGA纳米粒当前存在的问题与发展趋势

3本研究的目的意义

第二章山药多糖PLGA纳米粒制备条件的优化

1材料与仪器

1．1试验药物

1．2主要试剂

1．3主要器材

2方法

2．1 CYPP的制备

2．2 CYPP包封率及载药量的测定

2．3 CYPP制备工艺的优化

3结果

3．1葡萄糖标准曲线

3．2单因素试验结果

3．3响应面试验结果

3．4响应面优化分析

3．5纳米粒的形态表征

3．6 CYPP纳米粒和CYP的体外释放

4讨论

参考文献

第三章山药多糖PLGA纳米粒体外对小鼠脾脏淋巴细胞增殖的影响

1材料与仪器

1．1试验动物

1．2试验药物

1．3主要试剂

1．4主要仪器

2方法

2．1最大安全浓度测定

2．2淋巴细胞增殖测定

2．3 T细胞免疫分型

2．4数据分析

3结果

3．1最大安全浓度

3．2小鼠脾脏淋巴细胞增殖结果

3．3 T淋巴细胞免疫分型结果

4讨论

参考文献

第四章山药多糖PLGA纳米粒体外对树突状细胞免疫功能的影响

1材料与仪器

1．1试验动物

1．2试验药物

1．3主要试剂

1．4主要仪器

2方法

2．1 小鼠骨髓来源树突状细胞的培养

2．2 激光共聚焦扫描显微镜下观察树突状细胞对药物的摄取情况

2．3透射电子显微镜下观察树突状细胞的摄取情况

2．4树突状细胞表面分子表达情况的测定

3结果

3．1 激光共聚焦扫描显微镜下观察树突状细胞对药物的摄取结果

3．2透射电子显微镜下观察树突状细胞对纳米粒的摄取情况

3．3树突状细胞表面分子表达情况的检测结果

4讨论

参考文献

第五章山药多糖PLGA纳米粒对卵清白蛋白抗原的免疫佐剂活性

1材料与仪器

1．1试验动物

1．2试验药物

1．3主要试剂

1．4主要仪器

2方法

2．1 CYPP／OVA和BP／OVA纳米粒的表征测定

2．2动物分组及免疫

2．3免疫检测

2．4数据处理

3结果

3．1 CYPP／OVA和BP／OVA纳米粒的表征

3．2淋巴结中树突状细胞的活化水平

3．3脾脏淋巴细胞增殖率的变化

3．4各组T淋巴细胞活化的变化

3．5血清抗体滴度的变化

3．6细胞因子分泌的测定结果

3．7脾脏的组织学变化

4讨论

参考文献

全文结论

论文创新点

个人简历、攻读硕士期间发表的学术论文

致谢