枯草芽孢杆菌及其表面活性素抑制TGEV入侵猪肠上皮细胞的初步探究

摘要

猪传染性胃肠炎(Transmissible gastroenteritis，TGE)是由猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus，TGEV)引起的一种高度接触性、急性传染病。其攻击的靶细胞为仔猪肠上皮细胞，可引起仔猪严重的腹泻、呕吐、脱水，具有较高的死亡率，对中国乃至世界的养猪业造成了巨大的经济损失。因此，开发和研制抑制TGEV入侵的微生态制剂十分必要。枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是一种常用的益生菌，具有良好的拮抗病原微生物的特性，其次级代谢产物表面活性素surfactin在拮抗植物病原方面应用广泛，但在拮抗动物病原方面研究甚少。本研究以猪小肠上皮细胞（空肠）系（Porcine small intestinal epithelial cell line-jejunum2，IPEC-J2）为模型，首次报道了Bacillus subtilis OKB105及其surfactin可以在体外抑制TGEV入侵猪肠上皮细胞，并通过一系列试验对其存在的可能机制进行了探究，以期为防治TGE的发生提供新思路。 1.surfactin的提取、纯化和鉴定 surfactin是一种由芽孢杆菌分泌的环形脂肽，由一个环形七肽和一个C13-15的β-羟基脂肪酸构成。作为表面活性剂的杰出代表，surfactin具有极强的表面活性和乳化作用，不仅可拮抗细菌、真菌和支原体，对于有囊膜包被的病毒也有很好的破坏作用。目前surfactin主要用于植物病害的防治，但对于动物病原，尤其是动物病毒的拮抗作用研究较少。本试验首先利用酸沉淀的方法从高表达surfactin的Bacillus subtilis OKB105的发酵液中对surfactin进行了粗提，然后利用Sephadex LH-20层析柱进行纯化，通过基质协助激光解吸附离子化-飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)对其成分进行了分析，最后通过溶血性试验对其活性进行了鉴定。结果显示:提取到的脂肽化合物的主峰峰值m/z为1016.473、1030.484、1046.472、1058.636、1060.47、1074.48、1076.439、1082.469,是一组脂肪酸链为C13-16的surfactin的化合物;溶血性试验表明0.02mg/ml的surfactin可以形成直径≥8mm的溶血圈，证明其有着很好的生物活性。结果表明:本试验提取到了成分较为单一、活性较高的surfactin，可以用于下一步的试验研究。 2.Bacillus subtilis OKB105及其surfactin抑制TGEV入侵IPEC-J2细胞效果的研究 入侵是病毒侵入机体的第一步，TGEV的主要靶细胞是仔猪肠上皮细胞，为了将病毒感染阻止在第一步，以IPEC-J2细胞作为感染模型，探究了Bacillus subtilis OKB105及surfactin对于TGEV入侵的抑制效果。试验分组如下:Bacillus subtilis和surfactin分别处理TGEV1.5h后，将处理过的TGEV作用于IPEC-J2细胞（提前作用组）;Bacillus subtilis和surfactin分别与TGEV混合后共同作用于IPEC-J2细胞（共同作用组）;Bacillus subtilis和surfactin分别先与IPEC-J2细胞作用1.5h后再接毒（预作用组）。首先通过MTT的方法研究了Bacillus subtilis和surfactin的细胞毒性，并根据试验结果选择了后续试验中所用的的安全剂量，然后分别用荧光定量PCR(RT-qPCR)和Western-blot的方法从基因和蛋白水平上对Bacillus subtilis和surfactin抑制TGEV入侵的效果进行初步探究。结果显示:Bacillus subtilis168、OKB105和surfactin均具有较好的细胞安全性，选择Bacillus subtilis1×107cfu/ml，surfactin0.002mg/ml的浓度作为后续试验中的使用浓度;定量结果显示，surfactin在三种作用方式中对于TGEV的入侵均有明显的抑制作用;而Bacillus subtilis OKB105仅在可以直接和细胞接触的提前作用组和共同作用组中发挥作用;不能表达surfactin的Bacillus subtilis168只在提前作用组中发挥抑制作用。Westem-blot得到了相似的结果(P＜0.01)。结果表明:Bacillus subtilis和surfactin对于TGEV的入侵具有较为理想的抑制作用，不同处理方式中二者表现出效力的差别可能与其不同的作用机制有关。 3.Bacillus subtilis OKB105及其surfactin抑制TGEV入侵IPEC-J2细胞的机理初探 为了进一步探究Bacillus subtilis及surfactin抑制TGEV入侵IPEC-J2细胞的可能机理，首先通过病毒蚀斑试验研究了两者对TGEV的直接破坏作用;然后通过细菌的黏附试验研究了Bacillus subtilis对TGEV的黏附作用;再次，通过对存在于细胞表面的Toll样受体6(TLR-6)以及病毒入侵受体氨肽酶N（Aminopeptidase N，APN）和表皮生长因子受体（Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR）的检测，研究了Bacillus subtilis和surfactin对于IPEC-J2细胞的影响;最后通过流式细胞术对不同的试验处理引起的IPEC-J2细胞的凋亡水平的变化进行了检测。结果显示:surfactin可以直接破坏TGEV形成蚀斑的能力，并且呈剂量依赖性（P＜0.01）;两株枯草芽孢杆菌对TGEV均具有一定的黏附作用，且168的黏附效果优于OKB105;Bacillus subtilis的处理可以提高TLR-6、APN和p-EGFR的表达量(P＜0.01);Bacillus subtilis和surfactin都可以降低IPEC-J2细胞的凋亡水平。结果表明:surfacitn对TGEV具有破坏作用;Bacillus subtilis可以通过黏附病毒、上调IPEC-J2细胞表面TLR-6、APN和p-EGFR的表达量;Bacillus subtilis和surfacitn在一定程度上可以减少IPEC-J2细胞的凋亡。这为研究开发预防TGE的疫苗提供了理论基础。

目录

声明

摘要

中英文缩略表

引言

第一章猪传染性胃肠炎病毒的研究进展

1．1 病原体

1．2流行病学

1．3病理变化

1．4病毒的培养

1．5致病机理

1．6 TGEV疫苗的研究

第二章枯草芽孢杆菌的研究进展

2．1生物学特性

2．2．1 竞争作用

2．2．2生成抗生素类物质

2．2．3 溶菌作用

2．2．4提高宿主自身抵抗力

2．3枯草芽孢杆菌的应用

2．3．1 发酵工程方面的应用

2．3．2在植物病害生物防治中的应用

2．3．3在畜禽生产中的应用

第三章表面活性素surfactin的研究进展

3．1 surfactin的结构和理化特性

3．2 surfactin的生物合成

3．3 surfactin的发酵生产

3．4 surfacitn的生物活性及应用

3．4．1抗菌消炎活性

3．4．2抗支原体活性

3．4．3抗病毒活性

3．4．4溶血活性

3．4．5其他应用

第四章surfactin的提取、纯化及鉴定

4．1．1试验菌株

4．1．2试验试剂

4．1．3试验设备

4．1．4主要试剂配制

4．2．1 surfactin的提取及纯化

4．2．2 surfactin的鉴定

4．3试验结果

4．3．1 surfactin的纯度

4．3．2 surfactin的活性

4．4讨论

第五章Bacillus subtilis OKB105及其surfactin抑制TGEV入侵IPEC-J2细胞的效果研究

5．1．1试验菌株

5．1．2细胞和病毒

5．1．3试验试剂

5．1．4试验设备

5．1．5主要试剂配制

5．2试验方法

5．2．1病毒的纯化

5．2．2 Bacillus subtilis、surfactin抑制TGEV入侵IPEC-J2的效果评价

5．2．3数据分析

5．3试验结果

5．3．1 Bacillus subtil括及surfactin的细胞毒性

5．3．2 Bacillus subtilis及surfactin抑制TGEV入侵IPEC-J2的效果

5．4讨论

第六章Bacillus subtilis OKB105及其surfactin抑制TGEV入侵IPEC-J2细胞的机理初探

6．1试验材料

6．1．1细胞和病毒

6．1．2细菌和surfactin

6．1．3试验试剂

6．1．4试验设备

6．1．5主要试剂的配制

6．2试验方法

6．2．1病毒蚀斑试验

6．2．2 Bacillus subtilis对TGEV的吸附作用

6．2．4 Bacillus subtilis及surfactin对IPEC-J2细胞凋亡水平的影响

6．2．5数据分析

6．3试验结果

6．3．1 surfactin降低了TGEV的感染能力

6．3．2 Bacillus subtilis对TGEV的黏附作用

6．3．4 Bacillus subtilis上调IPEC-J2细胞的TLR-6的表达量

6．3．5 Bacillus subtilis及其surfactin降低了IPEC-J2细胞的凋亡水平

6．4讨论

参考文献

全文结论

致谢

论文发表情况