犬流感病毒单克隆抗体制备与ELISA检测方法的建立

摘要

犬流感(Canine influenza，CI)是由正粘病毒科流感病毒属A型流感病毒引起的犬呼吸道传染病。A型流感病毒的感染谱较广，可感染人、马、猪和禽类等多种动物。犬流感病毒(CIV)主要通过空气传播，但经消化道或通过接触病毒污染的各种物品也是重要的传播途径。过去一般认为犬不是A型流感病毒的易感动物，但近十多年来已陆续发现犬可被不同亚型的流感病毒所感染，患犬常出现喷嚏、咳嗽、发热和流涕等临床症状，死亡率为1％～5％。目前，犬流感病毒H3N2亚型在中国、韩国等亚洲国家及北美地区广泛流行，流感病毒已被证实可突破种间屏障，感染异种动物。犬作为人类的伴侣动物，与人类接触密切，目前虽尚未确认犬流感病毒是否感染人类及其他哺乳动物，但建立一种高效便捷的检测方法依然具有重要的公共卫生意义。现阶段检测CIV的方法包括病毒分离、琼脂扩散(AGP)试验、荧光抗体试验、血凝(HA)和血凝抑制(HI)试验、核酸探针技术和RT-PCR检测等。相对于这些方法来说，ELISA检测法更为简便，灵敏度和特异性更高;ELISA检测的成本较低，并可同时检测大量样品。本研究旨在制备抗犬流感病毒的单克隆抗体，建立CIV夹心ELISA检测法，为CIV的快速检测和诊断提供有价值的参考。 试验一、犬流感病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立 用纯化CIV抗原免疫BALB/c小鼠，将制备的脾细胞与状态良好的SP2/0骨髓瘤细胞融合，获得2株能稳定分泌抗CIV单克隆抗体(McAb)杂交瘤细胞株，将其命名为1F12和2A3，抗体亚类皆为IgM，将2株杂交瘤细胞分别注入小鼠腹腔，产生的抗体效价可分别达105和106。间接ELISA检测表明，2株单克隆抗体与其他多种病毒间无特异性反应;间接免疫荧光试验(IFA)证明，2株单抗均与CIV发生特异性反应;免疫印迹(western blot)分析发现，2株单克隆抗体均与CIV产生特异性蛋白条带。血凝抑制试验(HI)显示1F12腹水血凝效价为210，2A3无血凝效价。病毒中和试验显示，1F12的中和效价为12800，2A3无中和活性。 试验二、犬流感病毒单克隆抗体夹心ELISA检测法的建立 将单克隆抗体1F12用辣根过氧化物酶标记，作为酶标抗体，单克隆抗体2A3纯化后，作为包被抗体，建立CIV双抗体夹心ELISA检测法。试验结果表明，建立的双抗体夹心ELISA检测法特异性较好，与其他多种病毒间无交叉反应;将不同批次ELISA板条实施重复性检测，批间变异系数≤9.3％。用该法与RT-PCR法对34份临床样品进行检测，23份样品为阳性，11份为阴性，检测结果一致。本试验建立的双抗体夹心ELISA检测法有较好的特异性、敏感性和可重复性，可用于临床CIV诊断和检测。

目录

声明

摘要

缩略语

绪论

第一章犬流感的病原学与诊断

1犬流感病毒的病原学特性

1．1病原学分类

1．2犬流感的流行状况

1．3形态特点和理化特性

1．4基因组结构与编码蛋白

1．5病毒增殖特性

1．6 CIV种间传播机制

2 CIV的培养特性

3症状和治疗

4犬流感病毒的分离鉴定

4．1血凝试验(HA)和血凝抑制试验(HI)

4．2逆转录PCR检测

4．3 RT-LAMP检测

5疫苗和预防

6公共卫生学意义

7单克隆抗体技术

第二章犬流感病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

1材料与方法

1．1病毒、细胞和动物

1．2主要试剂

1．3杂交瘤细胞株的建立

1．4杂交瘤细胞的筛选

1．5单克隆抗体腹水的制备及纯化

1．6单克隆抗体亚类鉴定

1．7单克隆抗体效价测定

1．9单克隆抗体特异性鉴定

1．10血凝(HA)试验与血凝抑制(HI)试验

1．11单克隆抗体中和活性测定

2结果

2．1犬流感病毒抗原的制备

2．2杂交瘤细胞株的建立

2．3单克隆抗体的纯化

2．4单克隆抗体的亚类鉴定

2．5单克隆抗体的效价测定

2．6杂交瘤细胞株稳定性测定

2．7单克隆抗体特异性鉴定

2．8血凝(HA)试验与血凝抑制(HI)试验

2．9单克隆抗体中和活性测定

3讨论

参考文献

第三章犬流感病毒单克隆抗体夹心ELISA检测方法的建立

1材料与方法

1．1病毒与试剂

1．2单克隆抗体腹水的制备与纯化

1．3单克隆抗体的标记

1．4捕获抗体和酶标抗体工作浓度的确定

1．5夹心ELISA试验条件的优化

1．6夹心ELISA判定标准的确定

1．7特异性试验

1．8重复性试验

1．9 临床样品检测

2结果

2．1捕获抗体和酶标抗体工作浓度的优化

2．2夹心ELISA试验条件的优化

2．3夹心ELISA判定标准的确定

2．4特异性检验

2．5重复性试验

2．6临床样品检测

3讨论

参考文献

结论

附录

致谢