拟南芥二胺氧化酶(CuAOζ)及其转录因子MYB响应生长素信号的分子机理

摘要

生物胺是一类具有生物活性的含氮化合物，可以分为单胺和多胺。多胺普遍存在于高等植物中，根据其含有氨基数量的不同可以分为:二胺、三胺和四胺等二十多种多胺。植物中的多胺主要包括:腐胺（putrescine，Put）、尸胺(cadaverine，Cad)、精胺（spermine，Spe）和亚精胺(spermidine，Spd)。在植物体中，多胺调控细胞发育、种子萌发、衰老等重要过程;也参与调控干旱、冷害、盐害等非生物胁迫。多胺通过胺氧化酶进行分解代谢，胺氧化酶包括二胺氧化酶(Copper amine oxidase，CuAO)和多胺氧化酶(Polyamine oxidase，PAO)。二胺氧化酶(CuAO)主要降解腐胺、尸胺等二胺和多胺的初级氨基;多胺氧化酶(PAO)主要降解精胺(Spm)和亚精胺(Spd)等次级氨基。多胺的代谢产物主要包括H2O2、NH3等，其代谢产物H2O2在植物的生长、发育过程中具有重要作用。 拟南芥二胺氧化酶家族包含十个基因:CuAOα1、CuA Oα2、CuA Oα3、CuAOβ、CuAOγ1、CuAOγ2、CuA Oδ1、CuAOδ2、CuAOε和CuAOζ。本课题组前期工作已经证实，用外源生长素IBA(Indole-3-butyric acid，吲哚丁酸)处理WT和cuaoζ突变体幼苗，WT侧根密度和长度显著高于cuaoζ突变体;CuAOζ蛋白在主根皮层和内皮层特异性表达。本文将对CuAOζ应答生长素信号和调控侧根发育的分子机理进行进一步的研究。利用烟草瞬时表达体系，发现CuAOζ定位于过氧化物酶体。外源IBA处理可以诱导CuAOζ基因的表达。敲除CuAOζ基因会导致拟南芥幼苗二胺氧化酶活性的降低。我们利用ROS(reactive oxygen species，活性氧)特异性荧光探针和DAB染色技术，发现外源IBA处理促进WT和COM1皮层的H2O2含量显著升高，而cuaoζ的H2O2含量变化不显著。激光共聚焦观察发现，IBA处理后，WT和COM1中的生长素输出蛋白PIN2(PIN-FORMED)表达量相对较高，而cuaoζ含量相对较弱。PIN2基因的敲除导致IBA和H2O2诱导的侧根发育均受到抑制。上述研究结果表明，CuAOζ来源的H2O2可能通过调控PIN2蛋白的表达，进而影响生长素在根部的极性运输、分布，最终调控侧根发育。 利用基因截断遗传分析得知，CuAOζ基因的5'UTR是调控其在根尖时空表达的关键序列，暗示5'UTR可能受关键转录因子的调控。利用酵母单杂筛选技术，我们筛选到5'UTR序列的两个转录因子MYB和GATA2。我们构建了MYB启动子的GUS表达载体并在拟南芥植株中永久表达。GUS染色结果表明，MYB在拟南芥各组织均有表达，在主根和侧根的根尖部位表达更为强烈。外源IBA处理可以提高MYB的表达量。我们将PCuAOζ.CuAOζ-GFP-SKL转基因植株与myb突变体进行杂交。定量实验和共聚焦观察发现，在对照情况下，myb突变体中CuAOζ的表达显著高于WT;在IBA处理后，WT材料中CuAOζ的表达显著升高，而myb突变体中却无显著变化。因此，我们推测，MYB主要调控CuAOζ基因表达以应答生长素信号，而可能有其它的转录因子直接或间接调控CuAOζ本底水平。

目录

声明

摘要

符号及缩略语表

绪论

第一章文献综述

1生物胺的概述

2胺氧化酶的功能及其分类

第二节植物根的研究进展

1根冠

2分生区

3伸长区

4成熟区

5侧根发生

研究展望

第二章拟南芥二胺氧化酶响应生长素调控侧根发育

引言

1材料与方法

1．1培养基的配制

1．2拟南芥的培养和杂交

1．3拟南芥RNA提取和反转录

1．4 qRT-PCR和RT-PCR

1．5拟南芥材料的生长素和H2O2处理

1．6过氧化氢染色和PI染色

1．7 CuAO活性测定

1．8烟草瞬时表达

1．9本章实验所用引物序列

2结果与分析

2．2二胺氧化酶(CuAOζ)定位于过氧化物酶体

2．3 cuaoζ突变体中二胺氧化酶家族基因表达及蛋白活性的检测

2．4生长素诱导二胺氧化酶(CuAOζ)产生ROS

2．5 CuAOζ依赖PIN2调控侧根发育

3讨论

第三章拟南芥MYB响应生长素信号调控CuAOζ表达

引言

1实验方法

1．1基因克隆和载体构建

1．2拟南芥基因组DNA的提取

1．3酵母单杂交实验

1．4拟南芥cDNA文库转化和筛选

1．5 GUS染色

1．6拟南芥培养基配制、种子种植、植株杂交和筛选

1．7本章实验引物序列

2结果与分析

2．1二胺氧化酶转录因子的酵母筛选

2．2 myb突变体筛选和过表达材料的构建

2．3 MYB启动子GUS活性

2．4 MYB响应生长素信号调控CuAOζ基因的表达

3讨论

全文总结

创新之处

不足之处

参考文献

致谢