梨锈水病菌的分子检测技术研究及丁香假单胞菌黄瓜株系和甜瓜株系的碳源利用比较

摘要

梨锈水病是一种由细菌引起的病害，1973年在江苏省北部区域，部分梨树出现了主干流出铁锈色的粘性液体的病症，发病梨树轻则落叶减产重则整株枯死，给果农带来了巨大的经济损失。经采样分析后发现这是一种从未被报道过的细菌病害。发病梨树的主要症状主要是在枝干上产生带有酒糟气味的铁锈色粘液，故而取名“梨锈水病”，近年来梨锈水病在浙江、山东、德州也时常发生。经本实验室鉴定，梨锈水病原菌为迪基氏菌(Dickeya)属下的一个未报道的种，本实验室将其命名为方中达迪基氏菌D.fangzhongdai sp.nov.。在植物检疫方面，梨锈水病的发病症状与检疫性病害梨枯枝病类似，通过传统的检测技术难以区分。并且由于梨锈水病原菌是一种新的病原菌，目前国内还没有建立对其的分子检测技术，因此本实验旨在通过普通PCR、实时荧光定量PCR的方法，建立梨锈水病原菌的分子检测方法，能够对梨锈水病菌进行快速准确的检测，对病害的防治做出有益贡献。 首先，本研究利用生物信息学技术中的Blast比对方法将梨锈水病原菌与其他13种近缘菌进行全基因组对比，筛选出10个具有特异性位点的同源基因，并针对这些具有特异性位点的基因片段设计引物，进行PCR扩增验证。 其次，对于10对设计好的引物进行PCR的验证，筛选出两对特异性强、灵敏度高的引物，分别是根据胞外多糖基因cpsB以及hrp基因簇hrpV基因设计的特异性引物。这两对引物只能扩增梨锈水菌的特异性片段，对其属内的其他菌种及部分远缘细菌均无条带生成说明其高度的特异性，并且灵敏度可达10pg/μL。以此建立了梨锈水病的PCR的检测方法。 最后，设计了以同源基因hrpV同源基因为靶标的特异性TaqMan探针和引物，建立了梨锈水病原菌的实时荧光定量检测方法。检测灵敏度可达20copies/μL，是普通PCR检测方法的100倍，在一个小时内就可以完成检测。 本研究建立的普通PCR检测方法方便快捷，且成本低廉。荧光定量PCR方法灵敏度更高，用时更短，二者均能较好地将梨锈水病菌和其他迪基氏菌种区分，填补了梨锈水病分子检测的空白，为检测梨锈水病提供了新的方法。 丁香假单胞菌黄瓜致病变种(Pseudomonas syringae pv.lachrymans)引起的黄瓜细菌性角斑病在世界范围内皆有发生，造成不同程度的损失，同时也引起甜瓜细菌性叶斑病。以往研究表明黄瓜和甜瓜细菌性角斑病的病原均为丁香假单胞菌黄瓜致病变种，但在本实验室的研究中发现，丁香假单胞菌黄瓜致病变种黄瓜株系和甜瓜株系在致病性和分子生物学上存在一定差异。本研究利用Biolog细菌鉴定系统对黄瓜细菌性角斑病菌黄瓜株系和甜瓜株系的碳代谢活力分别进行了测定与比较。结果发现，丁香假单胞菌黄瓜株系和甜瓜株系属于不同的基因种。

目录

声明

摘要

上篇文献综述

第一章梨锈水病的研究现状

1梨锈水病的发生及危害

2梨锈水病的病原学研究

3梨锈水病的防治方法

第二章植物病原菌的检测和鉴定技术

1传统检测技术

2血清学检测技术

3植物病原细菌DNA分子生物学检测方法

第三章生物信息技术与分子检测靶点的发掘

1生物信息学简介

2生物信息数据库的建设

3序列分析方法

4生物信息学的应用

5我国出入境检疫工作对于生物信息学发展的要求

下篇研究内容

第一章用生物信息学方法发掘梨锈水病菌分子检测靶占

1方法与流程概述

2基于本地化的生物分析体系的构建

3梨锈水菌特异性基因序列的发掘

4讨论

第二章梨锈水病原菌特异性检测靶点的PCR评价

1材料与方法

2结果与分析

3结论

第三章应用Real-Time PCR检测梨锈水病原菌

1材料与方法

2结果与分析

3讨论

第四章丁香假单胞菌黄瓜株系和甜瓜株系的碳源利用比较

1材料和方法

2结果和分析

3讨论

参考文献

攻读硕士学位期间文章发表情况

致谢