猪圆环病毒2型高代次毒株致病性与Cap--SS亚单位疫苗免疫效果测定

摘要

猪圆环病毒2型(PCV2)是近些年来危害养猪业的重要病原体之一，可以诱发断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)在内的许多种临床上的疾病。PMWS主要表现为渐行性的消瘦、生长发育迟缓，淋巴结肿大、腹泻、皮肤苍白和黄疸。PCV2与PRRSV混合感染可以导致更加严重的症状与病变，升高死亡率。目前，疫苗接种是最有效的手段，但尚无商品化弱毒疫苗。本实验室采用PCV2SH毒株在PK15细胞连续传代至86代，命名为LP86毒株。本研究采用人工感染结合免疫刺激方法及PRRSV混合感染方法对该毒株的仔猪致病作用进行了评估。同时，采用小鼠免疫试验测定了一种新型PCV2Cap-SS亚单位疫苗的免疫效果，为PCV2疫苗研究奠定基础。具体内容如下: 1.猪圆环病毒2型LP86毒株对仔猪致病性研究 本研究选取35日龄PRRSV和PCV2阴性健康仔猪，进行仔猪攻毒试验。(1)PCV2感染试验:取10头健康仔猪，随机分为2组，每组5头，第1组攻毒PCV2-LP86，第2组为PBS对照组。PCV2-LP86攻毒后第4天和第7天，在每头猪的前肢两侧腋下及后肢两侧的臀部共4个点上注射弗氏不完全佐剂混匀乳化的钥匙孔血蓝蛋白，然后注射巯基乙酸培养基到仔猪腹腔进行免疫刺激，PCV2-LP86攻毒后的第11、19天再次注射巯基乙酸培养基到仔猪腹腔。PCV2-LP86攻毒后连续观察25天，记录临床症状，计算日增重，观察病理变化，检测血清中病毒血症和组织中病毒载量。结果显示，PCV2-LP86感染组与空白对照组未出现明显临床症状与病理变化，免疫组化检测猪腹股沟淋巴结内PCV2抗原，攻毒组只有1头出现棕黄色的阳性细胞。(2)PCV2与PRRSV共感染试验:取18头健康仔猪，设PCV2感染组（n=5头）、PRRSV+PCV2共感染组（n=5头）、PRRSV感染组（n=5头）和空白对照组(n=3头)。攻毒后每天测量体温并观察临床症状21天，每周采血，第0天与剖杀前称量体重，计算相对日增重。所有猪剖杀后观察病理变化，采用荧光定量PCR检测血清中病毒血症和组织中病毒载量。结果显示:①PCV2-LP86单独感染组与空白对照组未出现明显症状。PRRSV+PCV2-LP86共感染组与PRRSV单独感染组在攻毒后均出现高热萎靡，最高体温可达41℃以上，PPRSV组死亡1头。发病后期两组体温恢复但出现了拉稀现象。②PCV2-LP86单独感染组与空白对照组无明显病变，PRRSV+PCV2-LP86共感染组与PRRSV单独感染组均存在明显间质性肺炎，相差不明显。③PCV2-LP86组血清PCV2含量高于PRRSV+PCV2-LP86组，PRRSV+PCV2-LP86组血清中PRRSV含量与PRRSV组基本一致。④PCV2-LP86组淋巴结中PCV2含量与PRRSV+PCV2组相似，PRRSV+PCV2-LP86共感染组肺脏中PRRSV载量与PRRSV单独感染组无显著差异。该研究表明PCV2-LP86毒株对仔猪致病性较弱。 2.猪圆环病毒2型Cap-SS亚单位疫苗制备与小鼠免疫效果测定 本研究采用表达PCV2Cap蛋白和生长抑制激素多肽(SS)的7种大肠杆菌表达质粒，pET-32a-Capm-SS、pET-32a-SS-Capm、pET-32a-SS-Cap△10、pET-28a-SS-Capm、pET-28a-Capm-SS、pRSET-Capm-SS和pRSET-SS-Capm，分别于大肠杆菌获得可溶形式表达，制备纯化重组蛋白，经过Cap抗体和SS抗体Western blot鉴定，证明pET-32a-Capm-SS、pET-32a-SS-Capm、pET-32a-SS-Cap△10表达的重组蛋白表达量较大且具有较好反应特异性。将Capm-SS、SS-Capm、SS-Cap△10重组蛋白分别与Al01复合佐剂混合制备疫苗，两次免疫小鼠，首次免疫后第14天和28天尾尖采血，检测PCV2ELISA抗体效价，第0、14、28、42和56d称量所有小鼠体重，计算各组小鼠相对日增重。结果显示，首次免疫后两周，SS-Capm和SS-Cap△10的Al01佐剂免疫组即可诱导ELISA抗体，所有疫苗两次免疫2周后可以诱导小鼠产生较高水平的PCV2ELISA抗体。与PBS组比较，疫苗免疫组可以促进小鼠生长，其中SS-Cap△10疫苗组效果更佳，为PCV2新型疫苗研制奠定了基础。

目录

声明

摘要

第一章文献综述

1猪圆环病毒2型

1．1 PCV2基因组结构

1．2 PCV2主要编码蛋白

1．3 PCV2感染与发病

1．4 PCV2疫苗

2猪繁殖与呼吸综合征

2．1病毒基因组结构与编码蛋白

2．2 PRRSV的致病机制

2．3商品化疫苗

2．4新型实验疫苗

第二章猪圆环病毒2型LP86毒株对仔猪致病性研究

1材料与方法

1．1细胞和病毒

1．2试剂

1．3仔猪PCV2感染试验

1．4仔猪PCV2和PRRSV共感染试验

1．5临床症状统计

1．6荧光定量PCR检测淋巴结和血清中PCV2 DNA含量

1．7荧光定量PCR检测血清和肺脏中PRRSV RNA的含量

1．8病理学观察

1．9数据统计分析

2结果

2．1仔猪PCV2感染试验

2．2仔猪共感染试验

3讨论

参考文献

第三章猪圆环病毒2型Cap-SS融合蛋白亚单位疫苗制备与小鼠免疫效力研究

1材料与方法

1．1质粒、菌株和试剂

1．2质粒的表达鉴定与分析

1．3重组蛋白与疫苗制备

1．4小鼠免疫试验

1．5 PCV2 ELISA抗体检测方法

2结果

2．1重组蛋白特异性鉴定

2．2重组蛋白的表达

2．3疫苗制备

2．4小鼠免疫试验结果

3讨论

参考文献

全文总结

致谢