重组脑膜炎球菌PorB蛋白对猪伪狂犬弱毒疫苗的免疫增强效力研究

摘要

猪伪狂犬病是一种由伪狂犬病病毒引起的，可导致繁殖障碍的急性传染病。该病具有散播快、死亡率高、流行面广、传播方式多样、隐性感染等特点，给全世界养猪业带来了巨大经济损失。本病没有特效的治疗方法，免疫接种是预防和控制该病的主要措施。临床上使用的猪伪狂犬病疫苗有弱毒疫苗、灭活疫苗、基因工程疫苗和活载体疫苗。最常用的疫苗为弱毒疫苗和灭活疫苗，但近几年，由于弱毒疫苗存在毒力返强等缺点，造成仔猪免疫功能衰竭，从而使免疫失败，迫使人们不得不寻求更高效，安全的疫苗佐剂来增强疫苗的免疫效果，以达到预防和控制该病的目的。 脑膜炎奈瑟氏球菌也称脑膜炎双球菌，属于奈瑟氏菌属，是脑膜炎的病原体，蛋白体(OMPs)，是脑膜炎球菌的重要的抗原成分，是由三类孔道蛋白组成的囊泡，形状结构与纳米颗粒类似，能作为载体递送抗原到作用部位，同时又能作为免疫佐剂增强疫苗的免疫原性。蛋白体由PorA，PorB，class4三种孔蛋白组成，研究发现，蛋白体发挥免疫增强功能的主要组成成分是PorB蛋白分子。 本研究成功实现了重组PorB蛋白在E.coli中的可溶性表达，经纯化后，获得高纯度的蛋白作为PRV弱毒疫苗的稀释剂，初步探讨其对PRV弱毒疫苗的免疫增强效力，以期为流行毒株提供保护。本试验主要研究内容如下; 1.重组PorB蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达 在GenBank中查找脑膜炎球菌PorB蛋白氨基酸基因序列，对PorB基因进行大肠杆密码子优化后进行人工合成，将合成的基因插入到原核表达载体pET-32a中构建pET-32a-PorB表达载体。将鉴定正确后的载体转入E.coli BL21(DE3)中进行诱导表达。通过SDS-PAGE对目的蛋白的表达量和可溶性进行分析，利用Western-blot对目的蛋白的反应原性进行鉴定。SDS-PAGE电泳分析结果表明PorB基因在大肠杆菌中能够可溶表达，Western-blot结果显示，PVDF膜中在目的条带位置处有一条棕色条带。 2.重组PorB蛋白的免疫增强性初步研究 将表达产物进行Ni2+-NTA柱纯化，将每份含100μg纯化后的重组PorB蛋白与PRV弱毒苗混合后，分别鼻内免疫3日龄PRV阴性仔猪和肌肉注射免疫50日龄PRV阴性猪，免疫后14d、28d、42d后分别测定3日龄实验猪的IgG、IgA抗体水平和中和抗体水平;测定50日龄实验猪的IgG水平、中和抗体水平、淋巴细胞增殖强度和细胞因子(IFN-γ，IL-10，IL-6)的含量。动物试验结果表明;与疫苗单独免疫组和PBS对照组相比，含有重组PorB蛋白佐剂组的特异性中和抗体、IgA和IgG抗体水平显著升高(P＜0.05);且含有重组PorB佐剂组可以诱导机体产生较强的细胞增殖反应和较高的IFN-γ和IL-6细胞因子水平。通过本试验研究证明在猪伪狂犬弱毒疫苗免疫中，重组PorB蛋白可以作为一种优良的免疫增强剂，为未来发展的新型PRV弱毒疫苗佐剂奠定基础。 3.重组PorB蛋白在大肠杆菌表达条件的优化 通过对重组茵表达条件的摸索和优化，得出ZYM-5052自动诱导最优培养基成分为;2％蛋白胨、1％酵母提取物、2.5％甘油、0.05％葡萄糖、0.5％乳糖。在37℃培养1-2h，降温至15℃再培养20h。使用优化后的自动诱导培养基，可使重组PorB蛋白产量大幅度提高。

目录

声明

摘要

英文缩词表

绪论

第一部分文献综述

第一章蛋白体佐剂研究进展

1．1 概述

1．2 PorB蛋白作为疫苗佐剂的前景

第二章猪伪狂犬病研究进展

1 猪伪狂犬病在我国的流行简介

2伪狂犬疫苗研究进展

3 PRV弱毒疫苗佐剂的研究进展

4 展望

第二部分试验部分

第一章重组PorB蛋白的表达与纯化

1 实验材料

2方法与内容

3结果与分析

4讨论

参考文献

第二章重组PorB蛋白对3日龄仔猪滴鼻免疫增强效果初步研究

1材料与方法

2结果与分析

3 讨论

参考文献

第三章重组PorB蛋白对50日龄仔猪注射免疫PRV弱毒疫苗效果初步研究

1材料与方法

2结果及分析

3 讨论

参考文献

第四章重组PorB蛋白在大肠杆菌中表达条件优化

1材料与方法

2结果及分析

3讨论

参考文献

结论

附录

致谢

个人简历

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