捻转血矛线虫原肌球蛋白、组蛋白和谷胱甘肽过氧化物酶生物学特性分析

摘要

捻转血矛线虫（Haemonchus contortus）叉名捻转胃虫，属毛圆科(Trichostrongylidae)血矛属(Haemonchus)线虫，是反刍动物体内重要的寄生虫之一。在全世界每年可感染上亿只山羊和绵羊，损失可达数百亿美元。该病的防治工作面临着极其巨大的考验。目前，主要使用药物治疗该病，但是随着耐药性虫株不停地出现并在全球范围内逐渐蔓延，新药及疫苗的研发越来越受到人们的重视，分析捻转血矛线虫的基因并掌握捻转血矛线虫的免疫机理则为提供理论基础，让更好地对其基因的生物学功能进行分析及探索。 1.原肌球蛋白(TM)基因克隆、原核表达及生物学特性分析 根据Gene Bank中公布的捻转血矛线虫的TM基因序列设计特异性引物，将其克隆到pMD19-T载体中并对其序列进行分析，再将其亚克隆到pET32a(+)载体上，转化大肠杆菌BL21，用IPTG进行诱导。SDS-PAGE显示，该基因成功表达，融合蛋白分子量约为51kDa。Western blot结果显示该重组蛋白可被人工感染捻转血矛线虫山羊血清所识别。用免疫荧光技术检测出重组蛋白能够很好地结合山羊外周血单个核细胞(PBMC)。将TM与PBMC共同培养，用实时荧光定量PCR(qPCR)技术检测PBMC细胞因子表达的情况。结果发现，IL-4表达量在TM浓度为20μg/mL和40μg/mL下显著高于对照组，IL-2表达量在TM浓度为40μg/mL下显著高于对照组，IL-17表达量在TM浓度为20μg/mL下显著高于对照组，IL-10变化不明显。该重组蛋白TM能够使PBMC分泌NO的功能增强。用冰冻切片法分析TM蛋白在雌、雄虫体中的分布与定位情况，结果显示该蛋白在雌雄虫的肠道、肌肉和体表中均有分布。针对TM基因设计3条siRNA(S1-S3)和一条无关干扰RNA，用浸泡法将其导入活化3期幼虫，用qPCR技术检测干扰效率，结果显示，3条siRNA的干扰效率分别为87％、53％和41％。 2.组蛋白(H2A)基因的克隆、原核表达及生物学特性分析 根据Gene Bank中公布的捻转血矛线虫的H2A基因序列设计特异性引物，克隆该基因，序列进行分析正确后将其亚克隆到pET32a(+)载体上，转化大肠杆菌BL21，用IPTG进行诱导。SDS-PAGE显示，该基因成功表达，融合蛋白分子量约为32kDa。Western blot结果显示该重组蛋白可被人工感染捻转血矛线虫山羊血清所识别。用免疫荧光技术检测出重组蛋白能够很好地结合山羊PBMC。利用实时qPCR技术检测细胞中IL-2、IL-4和IL-17表达水平，结果发现，在重组蛋白H2A刺激下，细胞因子表达量没有明显变化。该重组蛋白H2A能够使PBMC分泌NO的功能增强。针对H2A基因设计3条siRNA(S1-S3)和一条无关干扰RNA，在体外用浸泡法将其导入活化的第3期幼虫，用qPCR技术检测干扰效率，结果显示，3条siRNA的干扰效率分别为75％、37％和65％。 3.捻转血矛线虫谷胱甘肤过氧化物酶(Hc29)的RNA干扰试验 根据捻转血矛线虫Hc29基因设计并合成了3条siRNA(S1-S3)和一条无关干扰RNA，在体外通过浸泡法将其导入活化的3期幼虫体内。根据Hc29基因和β-tublin基因设计qPCR引物，以干扰后不同组幼虫cDNA为模板进行qPCR检测，结果显示S1、S2和S3干扰效率分别为71％、31％和31％。然后选择干扰效率最高的S1并设置干扰组和对照组，72h后，分别将干扰组和对照组感染山羊，于感染后第21、23、25、27、29、31、33、35检测粪便中虫卵数，并对第29、31、33天的虫卵进行孵化，第36天杀羊取胃，分别收集雌雄虫，并对雌雄虫长度进行测定。人工干扰组幼虫感染的山羊体内捻转血矛线虫虫卵数、虫卵孵化率、雌虫数、雄虫数较对照组分别减少69.26％、79.16％、58.78％、71.63％。雌虫长度和雄虫长度分别减少23.52％、14.01％。

目录

声明

论文说明

摘要

前言

第一章捻转血矛线虫和捻转血矛线虫病

1病原学

1．1虫体形态特征

1．2生活史

2．1流行病学

2．2 临床症状及病理变化

2．3诊断与防治

第二章RNA干扰技术

1 RNAi技术

2 RNAi的作用机制

3．1线虫

3．2吸虫

3．3原虫

第三章捻转血矛线虫原肌球蛋白、组蛋白和谷胱甘肽过氧化物酶的研究进展

1原肌球蛋白(TM)

2组蛋白(H2A)

3谷胱甘肽过氧化物酶(HC29)

第四章捻转血矛线虫原肌球蛋白的克隆、原核表达及部分生物学特性分析

1．1虫体

1．2试验动物

1．3菌株和载体

1．4酶及其他试剂

1．5本试验所需溶液试剂的配制

1．6主要仪器设备

2方法

2．1 TM基因的克隆和原核表达载体的构建

2．2重组蛋白TM的表达及纯化

2．3重组蛋白TM浓度的测定

2．4抗血清的制备

2．5 Western blot分析

2．6重组蛋白TM与山羊PBMC的结合

2．7重组蛋白TM对山羊PBMC细胞因子表达的影响

2．8重组蛋白TM对山羊PBMC分泌NO功能的影响

2．9 TM在捻转血矛线虫雌、雄虫中的定位

2．10应用RNA干扰技术抑制TM基因的转录

3结果

3．1 TM基因的克隆和表达载体的构建

3．2重组蛋白TM的表达、分布及纯化

3．3 Western blot分析

3．4重组蛋白TM与山羊PBMC结合试验

3．5重组蛋白TM对山羊PBMC细胞因子表达的影响

3．6重组蛋白TM对山羊PBMC分泌NO功能的影响

3．7 TM蛋白在捻转血矛线虫雌、雄成虫中的定位

3．8应用RNA干扰技术抑制TM基因的转录

4讨论

参考文献

第五章捻转血矛线虫组蛋白基因的克隆、原核表达及部分生物学特性分析

1材料

2方法

2．1 H2A基因的克隆和原核表达载体的构建

2．2重组蛋白H2A的表达及纯化

2．3重组蛋白H2A浓度的测定

2．4抗血清的制备

2．5 Western blot分析

2．6重组蛋白H2A与山羊PBMC的结合

2．7重组蛋白H2A对山羊PBMC细胞因子表达的影响

2．8重组蛋白H2A对山羊PBMC分泌NO功能的影响

2．9应用RNA干扰技术抑制H2A基因的转录

3结果

3．1 H2A基因的克隆和表达载体的构建

3．2重组蛋白H2A的表达、分布及纯化

3．3Western blot分析

3．4重组蛋白H2A与山羊PBMC结合试验

3．5重组蛋白H2A对山羊PBMC细胞因子表达的影响

3．6重组蛋白H2A对山羊PBMC分泌NO功能的影响

3．7应用RNA干扰技术抑制H2A基因的转录

4讨论

参考文献

第六章RNA干扰Hc29基因对虫体生长发育的影响

1材料

2方法

2．5使用荧光定量技术检测干扰效率

2．6动物试验

3结果

3．1 Hc29基因qPCR引物扩增效率验证

3．2 siRNA干扰Hc29基因后体外转录水平

3．3虫卵数

3．4虫卵孵化率

3．5成虫减少率

3．6虫体长度减少率

4讨论

参考文献

全文总结

致谢