对硝基苯酚对细菌产生持留菌的影响及其相关机制研究

摘要

持留菌是某个细菌群体中一定比例表型异化的小亚群，它可通过暂时休眠或缓慢生长来耐受致死浓度抗菌药物的作用。为了维持持留菌的生存、菌体的结构稳定和应对不利环境的影响，持留菌主要采用“休眠-生长-增殖”的模式。细菌耐药持留现象最早是在治疗金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)感染时由Bigger发现，随后在大肠埃希菌(Escherichia coli)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)等细菌中均证实了持留菌的存在。由于持留菌的长期存在不断增加了菌株获得外源基因（耐药基因）的几率，并且细菌持留现象与反复感染、慢性感染的治疗失败等均密切相关，所以有关持留菌及其形成机制长期以来都引起了科学工作者们的广泛关注。 本研究首先在大肠杆菌和铜绿假单胞菌中，考察多溴联苯醚(BDE-15)、二苯基磷酸酯(BDP)、邻苯二甲酸二正辛酯(DNOP)、对硝基苯酚(PNP)、苯并芘(Bap)、β-六六六(β-HCH)、萘(Naphthalene)、水杨酸(Salicylicacid)8种有机污染物对细菌产生持留菌的影响，发现对硝基苯酚(PNP)可以增加细菌产生持留菌比例至少三个数量级。PNP是美国环保局分类的一种优先控制污染物之一，是一种重要的化工原料，广泛用于医学、机合成工业、炸药、生产杀虫剂，木材防腐剂和橡胶等领域，不断地在河流、湖泊、废水、土壤、空气和地下水从中检出。在废水中对硝基苯酚含量为3000-8000mg/L，严重威胁人体健康和水体安全。迄今为止，PNP对细菌产生持留菌的影响还未见相关报道。 在此发现之上，本研究采用氧氟沙星抗生素研究PNP对大肠杆菌和铜绿假单胞菌产生持留菌的影响及其相关机制。首先，比较了PNP不同浓度、作用不同时间和细菌生长不同时期对持留菌比例的影响，实验结果表明，当PNP作用菌体对数生长中期、时间为1h、浓度为400mg/L时对细菌产生持留菌比例影响最大。然后通过检测细菌自溶情况，发现PNP能够抑制两个菌体的自溶，包括:增加RNA的完整性、抑制蛋白质降解，细胞尺寸增加至少1.5倍，溶解氧含量会增加，在大肠杆菌中增加约2倍，在铜绿假单胞菌中增加约6倍，推测可能是PNP对细胞呼吸有抑制作用;通过转录组分析与实时荧光定量PCR检测，结果表明加入PNP后，cyoA、appC两个基因在大肠杆菌和铜绿假单胞菌中的表达量均显著下降;最后通过反义核酸实验证实抑制cyoA、appC的表达，持留菌的比例和原始菌株相比确实显著增加。

目录

声明

论文说明

摘要

绪论

第一章文献综述

1持留菌的发现及其特点

1．1持留菌的发现

1．2持留菌的特点

2持留菌形成的机制

2．1毒素／抗毒素系统(TA系统)的作用机制

2．2能量产生对持留菌形成的影响

2．3生物膜对持留菌形成的影响

2．4细菌的转运系统对持留菌形成的影响

2．5全局性调控因子对持留菌形成的影响

2．6蛋白酶系统对细菌产生持留菌的影响

2．7群体感应系统对持留菌形成的影响

2．8反式翻译对细菌形成持留菌的影响

2．9持留菌形成的其他机制

3持留菌研究的实验系统及持留菌的清除

3．1持留菌研究的实验系统

3．2持留菌的清除策略

4持留菌的临床威胁

5持留菌的药物治疗研究进展

5．1筛选针对持留菌的药物

5．2促进现有药物的活性

5．3基于吡嗪酰胺原理的持留菌感染治疗策略

6持留菌其他相关研究

7持留现象研究的不足与展望

8本研究的目的和意义

第二章不同污染物对细菌产生持留菌比例的影响

引言

1材料与方法

1．1实验材料

1．2实验方法

2结果

2．1不同污染物对细菌产生持留菌比例的影响

2．2大肠杆菌和铜绿假单胞菌产生持留菌的验证

2．3多药外排泵对细菌耐药性的影响

3讨论

4结论

第三章PNP对细菌产生持留菌比例的影响

引言

1材料与方法

1．1实验材料

1．2实验方法

2结果

2．1 PNP不同浓度对细菌产生持留菌比例的影响

2．2 PNP作用不同时间对细菌产生持留菌比例的影响

2．3 PNP对不同生长时期细菌产生持留菌比例的影响

3讨论

4结论

第四章PNP影响细菌形成持留菌的分子机制

引言

1材料与方法

1．1实验材料

1．2实验方法

2结果

2．1 PNP和CCCP对细菌自溶现象的影响

2．2 PNP对细菌持留菌影响的转录组分析

2．3 PNP对细菌持留菌影响的功能基因的实时荧光定量PCR分析

2．4 PNP对细菌持留菌影响的功能基因验证

3讨论

4结论

第五章全文总结

1全文总结

2主要创新点

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的论文