蚓粪中植物病原真菌拮抗菌的筛选和生防效果及机制研究

摘要

在作物生长过程中，植物真菌病害很容易发生，因此每年都会导致数千亿美元的经济损失，如何控制病害，保持植物的稳固生长一直是探究的热点。化学农药对于植物真菌病害的预防和控制做出了巨大的贡献;然而，化学农药的过量使用会造成土壤、水和空气的污染，提高农副产品中农药残留量，严重威胁着人类的健康和环境安全，除此之外病原体的耐药问题也不容小觑。上述问题制约了化学农药的使用，因而寻找新的高效无害的植物病害生物防治手段刻不容缓。通过筛选蚓粪中的拮抗微生物来防治植物病害，不但可以解决因为化学农药过多使用而引起的抗药性问题而且在一定条件下还可减少环境污染。因此，本文通过梯度稀释法及平板对峙法从蚓粪中筛选出了一株具有广谱拮抗性的细菌，并对其进行了分类鉴定。同时，研究了拮抗菌的生物防治作用及其拮抗机理。主要研究结果如下: 首先，以10种病原真菌为靶菌，采用梯度稀释法和平板对峙法对蚓粪中的拮抗菌进行初筛和复筛，共筛选到拮抗水稻纹枯病菌、黄瓜枯萎病菌、桃溃疡病菌和灰霉菌效果较好的拮抗细菌12、21、3和3株。在筛到的拮抗细菌中，菌株M29(16S rRNA GenBank登录号:KU870670)对水稻纹枯病菌、大丽轮枝菌和灰霉菌的抑制率分别可达95.3％、91.2％和89.4％。结合该菌株的形态变化特征、生理生化指标及16SrRNA基因序列分析初步鉴定为枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)。 其次，对菌株产生的次级代谢产物的拮抗活性进行测定。通过酸沉淀法提取的菌株M29产生的脂肽类粗提物对不同真菌的抑菌率在37％～97％之间，对桃溃疡病菌的抑制率最高，为97％，对烟曲霉的抑制率最低，为37％。通过平板倒扣法测定菌株M29产挥发性物质(VOCs)抑制病原菌菌丝生长的效果，其中对大丽轮枝菌的抑制率达65.3％;VOCs不仅能明显抑制烟曲霉孢子的生长，还可抑制多种病原菌色素的产生。通过GC-MS鉴定出菌株M29产生的11种挥发性物质(VOCs)，然后对这11种物质的标准物质进行平板倒扣试验发现，当标准物浓度为50μL时，正丁醇、乙酸正丁酯、顺-4-庚烯-1-醇、3-甲基-3-己醇能够完全抑制灰霉菌丝的生长;当标准物浓度为100μL时，呋喃-四氢-2，5-乙烷也能完全抑制灰霉菌丝的生长。2，6-二异氰酸酯甲苯、丙二醇丙醚、二苯甲酮等能够明显抑制灰霉菌丝的生长和孢子的萌发，导致菌丝表面皱缩，剥落，细胞质皱缩等。 最后，通过菌液浸泡番茄种子和对峙试验，测得M29菌株及其产生的挥发性物质(VOCs)对番茄胚芽的生防效果分别为91.2％和94.4％。通过盆栽试验发现菌株M29对灰霉病原菌的生防效果可达71.5％。

目录

声明

论文说明

摘要

第一章 文献综述

1植物真菌病害的研究进展

1．1植物真菌病害的致病途径及机理

1．2植物真菌病害的病状

1．3植物真菌病害的病原

1．4植物真菌病害的防治措施

2生物防治微生物的种类及生防机制

2．1生防细菌

2．2生防真菌

2．3生防放线菌

2．4生防机制

3蚯蚓粪对植物病害的抑制作用

3．1蚯蚓粪的物理性质

3．2蚯蚓粪的化学性质

3．3蚯蚓粪的生物学性质

3．4蚯蚓粪对植物病害的抑制作用

4本研究的内容和技术路线

4．1研究意义与内容

4．2技术路线

第二章植物病原真菌广谱拮抗菌M29的筛选、鉴定及其抑菌机制

引言

1试验材料

1．1蚯蚓粪(vermicompost)来源

1．2供试病原菌

1．3培养基

2试验方法

2．1拮抗菌的筛选与鉴定

2．2拮抗细菌菌株鉴定

2．3菌株M29的拮抗活性测定

2．4数据统计与分析

3结果与分析

3．1拮抗菌的筛选

3．2菌株M29的鉴定

3．3菌株M29的抗菌谱及抑菌率的测定

3．4菌株M29产脂肽类粗提物的抑菌活性测定

3．5菌株M29产VOCs的抑菌活性测定

4讨论

5小结

第三章菌株M29产挥发性物质(VOCs)的鉴定及活性验证

引言

1试验材料与方法

1．1拮抗菌和病原菌的准备

1．2菌株M29的拮抗活性测定

1．3菌株M29产VOCs对灰霉菌的拮抗活性的测定

1．4菌株M29产VOCs的测定(HS-GC／MS)

1．5高匹配度的活性组分的拮抗活性验证

1．6数据统计与分析

2结果与分析

2．1菌株M29的拮抗活性测定

2．2菌株M29产挥发性物质(VOCs)对灰霉菌拮抗活性的测定

2．3菌株M29产VOCs的测定(HS-GC／MS)及活性验证

3讨论

4小结

第四章菌株M29生防效果的验证与应用

引言

1试验材料

1．1土样

1．2菌株和番茄种子

1．3培养基

2试验方法

2．1菌株M29抑制病原真菌对番茄种子和水稻种子胚芽侵染的效果

2．2菌株M29产VOCs抑制病原菌对番茄和水稻种子胚芽侵染的效果

2．3盆栽试验中菌株M29对灰霉菌侵染番茄植株的生防效果

2．4数据统计与分析

3结果与分析

3．1菌株M29抑制水稻纹枯菌对水稻种子胚芽侵染的效果

3．2菌株M29抑制灰霉菌对番茄种子胚芽侵染的效果菌株

3．3菌株M29产VOCs抑制水稻纹枯菌对水稻种子胚芽侵染的效果

3．4菌株M29产VOCs抑制灰霉病原菌对番茄种子胚芽侵染的效果

3．5盆栽试验中菌株M29对灰霉病原菌侵染番茄苗的生防效果

4讨论

5小结

全文结论

创新点

研究不足和展望

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表及待发表的论文