大豆异黄酮合成关键酶基因GmIFS1和GmCHS7参与植物盐胁迫响应的研究

摘要

目前，全球土壤盐渍化有逐渐加重的趋势，盐胁迫成为限制农作物生长和增产的重要环境胁迫因子之一。大豆异黄酮类物质在体外具有显著的抗氧化活性，该类物质可能作为植物抗氧化系统的组成部分在植物应对逆境胁迫过程中发挥更多作用。由于异黄酮合酶(Isoflavones synthase，IFS)和查尔酮合酶(Chalcon synthase，CHS)是控制异黄酮类物质合成的关键酶，因此研究上述基因的表达调控及其对改善植物耐盐性的效应具有重要的研究意义。 在本文中，以栽培大豆N23674品种为材料，采用砂培法，在温室条件下研究不同浓度的盐胁迫对上述大豆植株生长及种子中异黄酮含量的影响。结果表明，80mM、100mMNaCl胁迫下，其株高、叶面积、鲜重同对照相比显著下降(P＜0.05)。保持盐胁迫直到种子成熟，收获不同生长阶段的种子用于测定异黄酮含量。结果表明，盐胁迫显著促进N23674成熟种子中异黄酮的积累。 对N23674幼苗进行80mM NaCl胁迫，盐胁迫时间为0h、2h及48h时取顶端成熟叶片和根用于IFS1和IFS2基因表达的荧光定量分析;盐胁迫2周后，取顶端成熟叶片用于异黄酮含量测定。结果表明，80mM NaCl胁迫促进叶片中IFS1和IFS2基因的表达及异黄酮含量的增加，但根部异黄酮增加并不显著。同时对根和叶片中CHS7基因表达进行荧光定量分析，结果表明该基因也会受到盐胁迫调控。克隆GmCHS7基因至表达载体pCambia1300用于发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）的转化和侵染，用于转化大豆子叶发根。对转基因发根进行分子鉴定后，取阳性转基因发根用于异黄酮含量测定。结果表明，盐胁迫促进了CHS7基因在根部和叶部的表达，但在转基因材料中，该基因的表达却没有显著促进异黄酮在发根中的积累。 将克隆得到的GmIFS1基因转化表达载体pCambia1300，用于发根农杆菌（Agrob-acterium rhizogenes）的转化和侵染。对转基因大豆子叶发根盐胁迫后，进行耐盐性测定，并测定异黄酮含量。结果表明，在对照条件下，对照发根和转GmIFS1基因发根中的异黄酮含量差异不显著(P＞0.05)，两者的生长情况也没有差异;在盐胁迫下，转GmIFS1基因发根的异黄酮含量会显著增加，其鲜重、相对含水量、根长与对照相比有显著差异（P＜0.05）。这说明，盐胁迫下GmIFS1基因的表达促进了大豆子叶发根中异黄酮含量的提高，并改善了转基因发根的耐盐性。 采用根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导的叶片法，将GmIFS1基因转化烟草（Nicotiana tabacum），经DNA分子鉴定、转基因拷贝数分析及RNA水平的表达分析，选取低拷贝转基因烟草进行耐盐性和叶部组织抗氧化分析。结果表明:在85mM NaCl胁迫下，转基因烟草的株高、叶组织鲜重显著高于野生型烟草，转基因烟草叶片的抗氧化性优于野生型烟草。IFS1基因的表达提高转基因烟草叶片的抗氧化性，并改善了转基因烟草的耐盐性。 将克隆得到CHS的编码序列在NCBI网站上进行比对，序列分析表明该序列同CHS7高度相似。构建含有GmCHS7基因表达载体pCambia1300后，由根癌农杆菌介导转化烟草，经DNA分子鉴定、拷贝数及RNA水平的表达量分析，选低拷贝数转基因烟草用于总黄酮含量测定、抗氧化及耐盐性分析。结果表明，在盐胁迫下，GmCHS7基因的表达促进烟草中总黄酮含量积累及叶片的抗氧化性的提高;与野生型烟草相比，转基因烟草植株高度和叶片鲜重都显著大于野生型烟草，GmCHS7基因的表达促进了烟草黄酮类物质的积累和耐盐性的改善。 综上研究表明，盐胁迫促进大豆植株体内异黄酮合成途径关键酶基因GmIFS1、GmIFS1和CHS7等基因表达及异黄酮的积累。在盐胁迫下，过表达GmIFS1或GmCHS7基因的大豆子叶发根或烟草体内异黄酮或黄酮类物质积累显著增加，这有利于改善它们的耐盐性。

目录

声明

摘要

第一章文献综述

1．1植物应对盐胁迫的机制

1．2植物细胞的抗氧化系统

1．2．1植物细胞中活性氧的产生

1．2．2植物的抗氧化酶系统

1．2．3植物的非抗氧化酶系统

1．3大豆异黄酮在植物体内的生理作用

1．4大豆异黄酮的研究进展

1．4．1大豆中异黄酮的化学性质及提取方法

1．4．2大豆异黄酮在豆科植物体内的分布

1．4．3大豆体内异黄酮的积累

1．4．4异黄酮在植物体内的代谢途径

1．5本文的研究目的和意义

第二章盐胁迫下大豆生长和种子中异黄酮含量的变化

2．1引言

2．2材料和方法

2．2．1材料的培养

2．2．2实验方法

2．3结果分析

2．3．1盐胁迫对大豆幼苗生长的影响

2．3．2盐胁迫对不同生长阶段大豆种子异黄酮含量的影晌

2．4讨论

2．4．1盐胁迫对大豆造成不同程度的伤害

2．4．2盐胁迫促进大豆种子中异黄酮的积累

第三章盐胁迫下大豆幼苗叶和根部组织中异黄酮含量及GmIFS1和GmIFS2基因表达的变化

3．1引言

3．2材料和方法

3．2．1材料培养

3．2．2异黄酮的提取及含量测定

3．2．4 RNA的提取和完整性检测

3．2．5 RNA的反转录

3．2．6基因的Real-Time PCR反应

3．2．7数据分析

3．2．8统计分析

3．3结果分析

3．3．1盐胁迫对大豆材料叶片中GmIFS1和GmIFS2基因的表达和异黄酮含量的影响

3．3．2盐胁迫对大豆材料根部中GmIFS1和GmIFS2基因的表达和异黄酮含量的影响

3．4讨论

第四章GmCHS7基因表达对大豆子叶发根中异黄酮含量的影响

4．1引言

4．2材料与方法

4．2．1材料的培养

4．2．2菌种及载体

4．2．3酶及其它生化试剂

4．2．4实验方法

4．3结果分析

4．3．1盐胁迫促进了CHS7基因在大豆材料根部和叶部的表达

4．3．2转GmCHS7基因发根的分子鉴定

4．3．3转GmCHS7基因发根的异黄酮含量测定

4．4讨论

第五章转GmIFS1基因大豆子叶发根的异黄酮含量和耐盐性

5．1引言

5．2材料与方法

5．2．1材料培养

5．2．2菌种及载体

5．2．5IFS1基因的CDS序列扩增

5．2．6目的片段的回收与连接

5．2．7克隆载体的构建

5．2．8表达载体的构建

5．2．9农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)K599感受态细胞制备

5．2．10质粒转化农杆菌K599

5．2．11大豆子叶发根的农杆菌转化、培养及盐胁迫

5．2．12酶及其它生化试剂

5．3结果分析

5．3．1大豆叶片中RNA的提取

5．3．2真核表达载体的构建

5．3．3大豆子叶发根的转化及异黄酮含量的测定

5．4讨论

第六章转GmIFS1烟草的耐盐性分析

6．1引言

6．2材料和方法

6．2．1转GmIFS1基因烟草的培养

6．3结果分析

6．4讨论

7．1引言

7．2材料和方法

7．2．1．1无菌烟草的培养

7．2．1．2大豆材料的培养

7．2．1．3 GmCHS基因表达载体的构建

7．2．1．4含GmCHS7基因的表达载体的构建

7．2．1．5农杆菌的转化

7．2．2．1烟草的转化

7．2．2．2转GmCHS7基因烟草的DNA分子鉴定

7．2．2．3转GmCHS7基因烟草DNA水平的拷贝数估算

7．2．2．4转GmCHS7基因烟草的半定量分析

7．2．2．5转GmCHS7基因烟草的耐盐性和总黄酮含量测定

7．3结果分析

7．3．1表达载体的构建

7．3．2烟草的转化和PCR分子鉴定

7．3．3转GmCHS7基因烟草的耐盐性分析

7．3．4转GmCHS7基因烟草叶片中总黄酮含量和抗氧化性测定

7．4讨论分析

全文讨论

全文结论

创新性

存在的问题和展望

参考文献

附录

致谢

攻读学位期间发表及投稿的学术论文目录