禽Ⅰ群腺病毒病病原和抗体检测方法的建立及其在血清学调查中的应用

摘要

禽腺病毒为线状双股DNA病毒，病毒粒子无囊膜;禽腺病毒属于腺病毒科禽腺病毒属。Ⅰ群禽腺病毒是禽腺病毒三个亚群中的一种，主要感染鸡，引起鸡的包涵体肝炎和心包积液综合征，由于该病毒主要侵害鸡的肝脏和免疫器官，造成免疫抑制，所以禽腺病毒病是禽类传染病中危害最为严重的疾病之一。2015年6月以来该病在我国各地暴发，给我国养禽业造成重大经济损失，也给我国的禽病防控带来巨大压力。目前该病还没有正规有效的疫苗用于预防，也没有有效的治疗措施。所以要做好疾病的监控，做到及时确诊和采取对症治疗等措施来减少损失。 禽腺病毒六邻体蛋白位于病毒粒子的表面，是最主要的衣壳蛋白，也是病毒粒子含量最高的结构蛋白，约占病毒总分子量的60％左右。六邻体抗原具有型、群和亚群特异性，为保护性抗原。 本研究以本实验室分离到的Ⅰ群禽腺病毒PZ株为研究对象，成功建立了传统PCR和LAMPⅠ群禽腺病毒病原检测方法以及hexon蛋白间接ELISA方法检测Ⅰ群禽腺病毒抗体的方法。本研究包括以下四部分内容: 试验一:禽Ⅰ群腺病毒PCR检测方法的建立及LAMP检测方法的建立和优化 为了建立禽Ⅰ群腺病毒病病原的检测方法，本试验参照GenBank中禽腺病毒Ⅰ群hexon基因序列，借助Oligo软件设计2条PCR引物，建立了传统的PCR检测方法，对PCR方法进行敏感性和特异性试验;借助Primer explorer V4设计4条LAMP引物，包括2条外引物F3、B3和2条内引物FIP、BIP。试验参照相关LAMP研究文献，对dNTP浓度、Mg2+浓度和甜菜碱的浓度等条件进行优化，并对其特异性和敏感性进行分析，建立了检测禽腺病毒的LAMP方法。PCR试验结果表明PCR方法具有很好的特异性，PCR方法能检测到稀释至10-7浓度提取的DNA;LAMP试验结果表明建立的LAMP检测方法的敏感性是传统的PCR的10倍，而且LAMP检测方法也具有很好的特异性。由此可以看出禽腺病毒LAMP检测方法的建立为临床禽腺病毒病原检测提供了一种更简便的方法。 试验二:禽Ⅰ群腺病毒hexon蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备 为了获得原核表达禽Ⅰ群腺病毒hexon蛋白，本试验参照Gen Bank中Ⅰ群禽腺病毒hexon基因序列，使用Oligo设计一对引物，通过对分离病毒株的hexon蛋白基因进行体外扩增克隆，构建含有酶切位点的hexon基因载体，测序比对后得到hexon蛋白基因序列，大小为1227bp，克隆至原核表达载体PET-32a中，成功构建表达质粒PET-32a-hexon，转化到大肠杆菌BL21，经IPTG诱导表达，SDS-PAGE对重组蛋白分析表明，hexon蛋白表达存在于包涵体中;以纯化复性后的hexon蛋白作为抗原免疫SPF来航鸡获得了效价较高的鸡抗hexon蛋白血清，用鸡抗hexon蛋白抗体孵育hexon蛋白进行Western blot，可在预计目的蛋白位置产生明显棕色条带。用此作为抗原制备的鸡抗hexon蛋白血清，为后续建立ELISA方法奠定了基础。 试验三:禽Ⅰ群腺病毒hexon蛋白间接ELISA方法的建立及其优化 为建立hexon间接ELISA抗体检测方法，本试验利用试验二中原核表达纯化的PZ病毒株hexon作为包被抗原，对抗原的包被浓度、血清最佳稀释度、包被条件、封闭条件、封闭液、一抗和二抗反应时间等反应条件进行优化，建立了禽Ⅰ群腺病毒抗体的间接ELISA方法。结果表明:抗原的最佳包被浓度为1.5μg/mL，血清最佳稀释度1∶800，最佳包被条件为4℃过夜，最佳封闭条件为用1％BSA作为封闭液37℃封闭1h，，待检血清最佳反应时间30min，酶标二抗最佳反应时间为45min。通过测定40份阴性血清的OD450值确定了阴阳性临界值。试验建立的间接ELISA方法为禽Ⅰ群腺病毒病抗体检测和流行病学调查提供简单快捷的血清学检测方法。 试验四:邳州市部分肉鸡养殖场鸡腺病毒抗体水平调查 为了调查邳州市2015年禽Ⅰ群腺病毒的抗体水平，同时也检测试验三所建立的hexon间接ELISA方法的实用性，本试验用建立的间接ELISA方法对从邳州采集的160份鸡血清进行禽Ⅰ群腺病毒抗体的检测。结果显示:邳州地区2015年7～10月血清样品阳性抗体比率为15.6％，其中8月血清阳性率最高为30％，9～10月血清阳性率出现了明显下降。抗体水平的结果与该病在邳州地区的流行情况相符，这表明我们已经建立的间接ELISA方法具有很好的临床实用性。

目录

声明

摘要

符号与缩略语

第一章禽Ⅰ群腺病毒的研究进展

1病原学

1．1分类

1．2形态学及理化特性

1．3腺病毒的增殖

1．4腺病毒的感染与复制

2主要蛋白

2．1结构蛋白

2．2非结构蛋白

3流行病学

4临床症状与病理变化

5预防与治疗

6诊断方法

6．1病毒的分离鉴定

6．2血清学诊断

6．3分子生物学诊断

第二章禽Ⅰ群腺病毒PCR检测方法的建立及LAMP检测方法的建立和优化

1材料

1．1试剂

1．2试验器材

2试验方法

2．1病毒的扩增

2．2病毒基因组的提取

2．3传统PCR检测方法的建立

2．4禽腺病毒LAMP检测方法的建立及优化

3结果

3．1 PCR方法的建立

3．2 PCR检测方法的特异性试验

3．3 PCR检测方法的敏感性

3．4 LAMP检测方法的建立

3．5 LAMP试验的优化

3．6 LAMP特异性试验

3．7 LAMP敏感性试验

3．8对FAdV临床样品的检测

4讨论

参考文献

第三章禽Ⅰ群腺病毒hexon蛋白的原核表达及鸡抗hexon蛋白血清制备

1材料

1．1质粒和试剂

1．2试验器材

1．3试验动物

2试验方法

2．1病毒增殖

2．2病毒基因组的提取

2．3 hexon基因克隆和扩增

2．4重组原核表达质粒PET-32a-hexon的构建

2．5重组质粒PET-32a-hexon的鉴定

2．6重组质粒PET-32a-hexon的基因序列测定

2．7 hexon基因在BL21中的诱导表达和检测

2．8原核表达hexon蛋白的可溶性检测

2．9原核表达hexon蛋白的复性

2．10原核表达hexon蛋白鸡多抗血清的制备

3结果

3．1 hexon基因的PCR扩增结果

3．2 PCR筛选阳性菌株

3．3重组质粒PET-32a-hexon双酶切鉴定结果

3．4重组质粒PET-32a-hexon的测序结果

3．5重组质粒PET-32a-hexon在BL21中的表达鉴定

3．6 hexon蛋白的Western-blot

4讨论

参考文献

第四章hexon间接ELISA抗体检测方法的建立及其优化

1材料

1．1血清

1．2主要试剂

1．3间接ELISA方法的操作程序

1．4间接ELISA方法的建立和优化

2结果

2．1间接诊断方法最佳工作条件的确定

3讨论

参考文献

第五章邳州市部分肉鸡养殖场鸡腺病毒抗体水平调查

1材料

1．1血清

1．2仪器与试剂

2方法

3结果

4讨论

参考文献

全文总结

致谢