犬流感病毒NP蛋白的表达及其抗体间接ELISA检测方法的建立

摘要

犬流感(canine influenza，CI)是由犬流感病毒(canine influenza virus，CIV)引起的犬的呼吸道传染病，患犬表现为发热，食欲减退等呼吸道症状。由于犬与人类接触的机会较多，流感病毒很容易通过犬传染给人。因此，加强对该病毒的检测具有重要的公共卫生学意义。 本研究用鸡胚扩增H3N2犬流感病毒，提取病毒的RNA后进行反转录，得到cDNA。根据GenBank中登录的NP基因序列(JN247620.1)设计引物，用PCR对片段进行扩增，然后将其连接到pMD18-T载体上。测序正确的质粒用限制性内切酶酶切后，将目的基因分别连接至原核表达载体pGEX-4T-1、pET-28a和真核表达栽体pFastBac-HTA上。构建成功的质粒分别命名为NP-pGEX-4T-1、NP-pET28a和NP-pFastBacHTA。将重组原核表达质粒分别转化BL21(DE3)和Rosetta(DE3)两种宿主菌，使用IPTG对其进行诱导。对菌液进行SDS-PAGE，可见82.82kD和59.98kD大小的特异性条带，其中NP-pET28a质粒在Rosetta(DE3)宿主菌中对重组蛋白NP的表达效果最好，IPTG对其最佳的诱导浓度和诱导时间分别为0.8mM和5h，蛋白多以包涵体形式存在。对菌体进行超声破碎，收集包涵体，经变性和尿素梯度复性后用HisTrapTMHP柱纯化，Western blot分析证明其反应原性良好。将NP-pFastBacHTA转化含Bacmid DNA和Helper plasmid的DH10Bac感受态，PCR鉴定后，提取阳性菌中的穿梭质粒，命名为NP-DH10Bac。用NP-DH10Bac穿棱质粒转染昆虫细胞sf-9，等细胞完全病变后收集细胞上清，即为重组病毒P1-NP。病毒传至第3代后，用Western blot及IFA鉴定昆虫细胞表达的蛋白与兔抗犬流感病毒NP蛋白多抗及鼠抗CIV血清发生特异性反应。 将纯化后的原核与真核表达的重组蛋白分别作为包被抗原建立检测犬血清的抗体间接ELISA检测方法，其中真核表达蛋白的特异性更高，优化后确定其抗原的最佳包被浓度为2μg/ml，一抗犬血清的最佳稀释度为1∶100，二抗的稀释倍数为1∶5000，cut-off值为0.229。用建立的间接ELISA方法和血凝抑制(HI)同时检测136份犬血清样品，其中ELISA法检出129份阳性，检出率为94.85％;HI检出120份阳性，检出率为88.23％，两种检测方法的符合率为93.38％，ELISA方法的阳性检出率高于HI。 综上，本试验成功获得原核和真核表达的重组NP蛋白，其中利用真核表达的NP蛋白作为包被抗原，建立的检测犬流感抗体间接ELISA方法特异性好，重复性高，可用于犬流感的诊断和犬群的监控。

目录

声明

摘要

缩略语及符号

绪论

第一章犬流感的流行及检测方法研究进展

1犬流感的分布与流行

1．1 H3N8亚型犬流感

1．2 H5N1亚型犬流感

1．3 H3N2亚型犬流感

1．4 H5N2亚型犬流感

1．5 H1N1亚型犬流感

1．6其他亚型犬流感

2流感病毒的分子结构与理化特性

2．1流感病毒的形态结构

2．2流感病毒的理化特-性

3流感病毒的生物学特性

3．1增殖特性

3．2血凝特性

4流感病毒的分子特性

4．1聚合酶蛋白

4．2 HA蛋白

4．3 NP蛋白

4．4 NA蛋白

4．5 M蛋白

4．6 NS1和NS2蛋白

5犬流感病毒的检测方法

5．1流感病毒的分离及鉴定

5．2血清学检测方法

5．3分子生物学检测方法

6 CIV的危害及公共卫生学意义

7 研究目的与意义

第二章H3N2亚型犬流感病毒核蛋白的原核及真核表达

1材料与方法

1．1 材料

1．2方法

2结果

2．1 原核表达

2．2真核表达

3 讨论

第三章重组NP蛋白抗体间接ELISA检测方法的建立

1材料与方法

1．1材料

1．2方法

2结果

2．1 最佳抗原及其包被浓度及血清稀释度的选择

2．2最佳抗原包被条件的确定

2．3最佳封闭剂的选择

2．4最佳封闭时间的选择

2．5最佳血清作用时间的确定

2．6最佳二抗稀释倍数的确定

2．7最佳二抗作用时间的确定

2．8最佳显色时间的确定

2．9临界值的确定

2．10间接ELISA方法的灵敏性

2．13 间接ELISA检测方法与HI方法的比较

3讨论

全文总结

本文创新点

参考文献

附录

致谢

攻读学位期间发表的学术论文