猪链球菌2型宿主结合蛋白的鉴定及免疫保护力分析

摘要

猪链球菌（Streptococcus suis，S.suis,SS）是一种危害严重的人畜共患病原菌。在33个血清型中，猪链球菌2型（Streptococcus suis serotype2，SS2）致病性最强，研究最为广泛，在世界范围内被报道为最主要的致病血清型。控制猪链球菌感染的重点是预防，不同类型疫苗的研制至关重要。弱毒疫苗免疫效果好但存在毒力返强的危险且保存运输要求高。灭活疫苗安全性高、保存方便，但免疫效果不佳，且需多次免疫。亚单位疫苗成分单一，避免了许多无关抗原诱发的抗体，从而减少疫苗的副作用和疫苗引起的相关疾病，对它的研究给新型有效的猪链球菌疫苗的发现带来了希望。细菌表面蛋白通过与宿主细胞外基质(Extracellular matix，ECM)蛋白如纤连蛋白(Fibronectin，FN)和层粘连蛋白(Laminin，LN)结合在细菌对宿主的粘附过程中发挥重要作用。而粘附是细菌定植和发挥致病作用的第一步。因此，ECM结合蛋白(ECMbinding protein)对应的抗体可能中和细菌表面的ECM结合蛋白而使细菌的粘附作用下降，致病力减弱。本研究对猪链球菌重组FN/LN结合蛋白进行表达纯化，评价它们作为亚单位疫苗的免疫保护性，主要包括第1-3部分。 细菌入侵宿主除了要结合宿主上固定态的ECM分子外，还要和游离态分子如补体系统的H因子(Factor H，FH)结合。ECM分子如FN和LN在细菌致病作用过程中发挥重要作用，而FH也与抗SS2感染息息相关。SS2必须逃避宿主先天免疫防御系统如补体系统，才能在血液中存活并增殖，从而引起脑膜炎和败血症等疾病。H因子结合蛋白(Factor H-binding proteins，FHBPs)通过招募富集补体负调节子FH，抑制补体替代途径C3b的活化，同时把已经活化的C3b降解为失活的iC3b，从而帮助SS2逃避补体介导的宿主天然免疫及吞噬杀伤，使其得以在血液中存活。然而，SS2与FH结合的分子机制尚不明确，可能由SS2表面的FHBPs介导。本研究筛选结合宿主FH的SS分泌蛋白并对它们进行了初步功能研究，主要包括第4部分。 1.猪链球菌FN/LN结合蛋白的表达纯化及抗体制备 前期我们通过蛋白组学和Far-Western Blotting相结合的方法，筛选到了15种潜在的LN结合蛋白和5种潜在的FN结合蛋白。其中，elongation factor Tu(EF-Tu)、lactate dehydrogenase(LDH)、fructose-bispho sphate aldolase(FBA)、Enolase、oligopeptide-binding protein OppA precursor(OppA)和3-ketoacyl-ACP reductase(KAR)的LN结合活性均为第一次被报道。EF-Tu和LDH的FN结合活性也是第一次被报道。本研究选择EF-Tu、FBA、LDH、Enolase、OppA和KAR这6个蛋白进行原核表达和纯化，得到了6种高纯度的融合蛋白。再将这6种蛋白分别免疫试验兔制备得到了这6种融合蛋白对应的多克隆抗血清。 2.重组FN/LN结合蛋白的体外特性分析 体外全血存活试验被用来评价SS2表面蛋白在细菌致病过程中的作用。实验结果表明用抗EF-Tu、FBA和LDH抗体封闭细菌表面蛋白后，SS存活率有明显下降，即EF-Tu、FBA和LDH抗血清表现出对机体的保护作用，所以这3个蛋白被选来进行后续研究。 对EF-Tu、FBA和LDH这3种蛋白进行免疫原性分析。重组蛋白与康复血清的免疫印迹试验结果表明EF-Tu、FBA和LDH均能与康复血清发生反应。天然细胞壁蛋白和分泌蛋白与各蛋白对应的兔抗多克隆血清的免疫印迹试验结果表明，抗血清能够识别SS2裂解物中的天然蛋白EF-Tu、FBA和LDH。综上我们得出，在猪链球菌感染宿主的过程中，EF-Tu、FBA和LDH能够在宿主体内表达且具有免疫原性，这为接下来的试验奠定了理论基础。 3.重组蛋白在两种品系小鼠模型上的免疫保护性评价 两种品系小鼠模型（BALB/c和ICR）被用来进一步评价EF-Tu、FBA和LDH的免疫保护性。小鼠经过三次免疫后，采血并用ELISA方法测定抗体效价。待小鼠体内产生较高水平的抗体后，采用腹腔注射对小鼠进行攻毒，观察小鼠的发病率与死亡率。结果表明，EF-Tu、FBA和LDH在BALB/c小鼠体内产生的平均抗体滴度分别是1∶21333，1∶42667，1∶42667;在ICR小鼠体内产生的平均抗体滴度分别是1∶170667，1∶42667，1∶149333。但是，小鼠体内较高水平的抗体却没能对机体感染SS2产生有效的免疫保护作用，提示这几种蛋白并非SS的保护性抗原。 4.结合宿主FH的SS分泌蛋白筛选及初步功能研究 细菌FHBPs通过招募富集宿主游离态分子FH，抑制补体系统活性C3b在细菌表面的沉降，从而有助于其逃避补体介导的宿主天然免疫和吞噬杀伤。我们在前期研究中，用2D-Far-Western blotting的方法在猪链球菌细胞壁蛋白中鉴定到14种潜在的新型FHBPs。并对其中的8种蛋白进行生物学功能分析以探究FH在SS2致病过程中的作用。结果表明，FH结合到细胞表面有助于SS2对HEp-2细胞的粘附和侵袭并使SS2毒力增强，从而有助于SS2抵抗杀伤。本研究在前期研究的基础上，同样运用2D-Far-Western bloting的实验方法从SS2分泌蛋白中进行FHBPs的筛选，并对这些蛋白进行初步生物学功能分析，为猪链球菌致病机理的补充和完善提供思路。

目录

声明

摘要

英文缩略词表

绪论

第一章猪链球菌概述及宿主结合蛋白研究进展

1猪链球菌概述

1．1 猪链球菌病原学与血清分型

1．2猪链球菌流行病学

2细胞外基质与细胞外基质结合蛋白

2．1 纤连蛋白与纤连蛋白结合蛋白

2．2层粘连蛋白与层粘连蛋白结合蛋白

2．3 FN／LN结合蛋白在其他细菌上的免疫保护力研究

3猪链球菌疫苗研究进展

3．1全菌苗

3．2母源性被动免疫

3．3减毒活疫苗

3．4亚单位疫苗

4 FH和FHBPs的研究进展

4．1 补体系统替代途径概述

4．2 FH和FHBPs的研究进展

第二章猪链球菌FN／LN结合蛋白的重组表达与纯化

1材料与方法

1．1菌株与质粒

1．2主要试剂与仪器

1．3细菌培养与基因组提取

1．4引物设计与表达菌株构建

1．5诱导表达与蛋白纯化

1．6多克隆抗体制备及抗体效价检测

2 结果

2．1 ef-tu，ldh，fba，enolase，kar和oppa基因表达菌株的获得

2．2亲和层析技术纯化得到HIS标签融合蛋白

3 讨论

第三章重组FN／LN结合蛋白的体外特性分析

1材料与方法

1．1菌株及生物材料

1．2主要试剂及主要仪器

1．3全血存活试验评价蛋白在细菌抗杀伤过程中的作用

1．4蛋白EF-Tu、FBA和LDH的免疫原性分析

2 结果

2．2重组蛋白EF-Tu、FBA和LDH具有良好的免疫原性

3 讨论

第四章重组蛋白在两种品系小鼠模型上的免疫保护性评价

1材料与方法

1．1菌株与生物材料

1．2主要试剂与主要仪器

1．3 BALB／c和ICR小鼠免疫

1．4抗体效价测定

1．5小鼠攻毒试验

2结果

2．1重组蛋白诱导机体产生较高水平的抗体滴度

2．2重组蛋白的动物保护力评价

3讨论

第五章结合宿主FH的SS分泌蛋白筛选及初步功能研究

1材料与方法

1．1菌株

1．2主要试剂与仪器

1．3 ZY05719分泌蛋白提取

1．4等电聚焦分析

1．5 SDS-PAGE

1．7 FHBPs蛋白纯化及多抗制备

1．8间接免疫荧光试验分析FHBPs与细胞的结合特性

2结果

2．1运用2D-Far-Western blotting的实验方法筛选到3种FHBPs

2．2 成功构建得到3个蛋白的表达菌株并纯化得到融合蛋白

2．3 EXO、HDH和Hp07325粘附HEp-2细胞和bEnd．3细胞

3 讨论

全文总结

参考文献

致谢

发表及待发表文章