番茄免疫受体Sw--5b对Tospovirus广谱抗性的分子机制研究与我国TSWV Tsw抗性突破株系的遗传差异分析

摘要

番茄斑萎病毒属（Tospovirus）包括多种检疫性病毒，番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus，TSWV）是其代表种，在世界各地皆有分布，我国境内主要集中在西南地区。抗性品种选育是对抗病害的一种有效途径，目前针对TSWV并已商业化的抗性基因只有Sw-5b和Tsw两种。 1.番茄免疫受体Sw-5b对Tospovirus广谱抗性的分子机制研究 植物和动物的细胞内核苷酸结合寡聚结构域样受体(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors，NLRs)在监测和阻止不同的病原物侵染时发挥重要作用。动物的NLRs一般通过识别病原物相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)赋予寄主抗性，而植物NLRs则通过识别病原物编码的特异性效应因子来赋予寄主抗性。本研究中，我们揭示了番茄Sw-5b NLR通过识别病毒移动蛋白NSm的一段21aa的保守肽段(NSm21)来赋予对不同美洲型Tospoviruses的广谱抗性。全长Sw-5b和NB-ARC-LRR结构域直接与NSm21在体外和植物体内互作。通过位点直接突变和结构模型分析，推测Sw-5b LRR上的R927是与NB-ARC互作的重要位点，R927位点的突变能使Sw-5b由自抑制状态转变为激活状态。因此，Sw-5b对的NSm21识别很可能减弱了LRR和NB-ARC结构域的分子间互作，从而最终激活Sw-5b。本研究的结果首次提供了植物NLR通过识别一个小而保守的病原物效应因子衍生的短肽赋予广谱抗性的例子。 2.我国TSWV Tsw抗性突破株系的遗传差异分析 携带Tsw基因的抗性辣椒已被广泛运用于农业生产，但这也迅速造成全世界范围内抗性突破型TSWV株系(resistance breaking，RB)的出现。然而，迄今为止在中国境内尚未有关于TSWV RB株系的报道。近些年来，TSWV引起的病毒病在中国西南的云南省呈现快速增长的趋势。而目前有关TSWV不同株系之间多样性的研究仍是空白。本研究以云南省境内不同寄主上采集的TSWV为研究对象，首次发现在自然条件下TSWV RB株系的产生。我们最初从2012年采集于云南省的莴苣样本上分离出TSWV莴苣株系(TSWV-LE)。令人惊讶的是，TSWV-LE可以引起携带Tsw抗性基因的辣椒的系统坏死。我们紧接着于2015年采集并发现番茄上分离的株系(TSWV-YN18)和烟草上分离的株系(TSWV-YN53)也能实现对Tsw介导的抗性突破。不同的是TSWV-YN18诱导抗性辣椒出现系统环斑，而YN53引起系统褪绿斑驳。TSWV编码的NSs蛋白的突变是形成Tsw的抗性突破株系的关键因素。我们发现TSWV-LE的NSs蛋白保留了诱导HR的能力，而TSWV-YN18和TSWV-YN53已不能诱导HR的产生。但是，这三个RB株系的NSs蛋白都能抑制RNA沉默。序列分析表明云南境内的RB株系与其他以前报道的RB株系的NSs蛋白之间并未发现氨基酸的特征位点。然而LE株系的NSs蛋白的两个氨基酸位点(F74和K272)导致了它与YN18和YN53RB株系之间的明显不同。不同RB株系的出现和Tsw介导抗性防控的失败，给中国西南地区本土辣椒作物的种植造成了严重威胁。

目录

声明

摘要

绪论

第一章文献综述

1植物的免疫系统

1．1 病原物相关分子模式(PAMPs)触发的免疫(PTI)

1．2效应因子(Effector)触发的免疫(ETI)

2 TSWV

2．1 Tospovirus的分类、危害与传播

2．2 TSWV的基因组结构与所编码蛋白的功能

2．3抗性蛋白Sw-5b与移动蛋白NSm

2．4抗性蛋白Tsw与RNA沉默抑制子NSs

第二章番茄免疫受体Sw-5b对Tospovirus广谱抗性的分子机制研究

1材料与方法

1．1病毒来源

1．2植物材料

1．3 引物

1．4 DNA提取

1．5 RNA提取与反转录

1．6载体构建

1．7割胶回收

1．8胶回收产物加A

1．9加A产物与载体连接

1．11阳性筛选克隆与测序

1．12质粒提取

1．13转化农杆菌GV3101感受态细胞

1．14农杆菌处理

1．15农杆菌浸润

1．16原核表达

1．17酶联免疫吸附分析(ELISA)

1．18免疫共沉淀(Co-IP)

1．19蛋白质体外结合实验(Pulldown)

1．20 Western-blot

1．21 过敏性坏死反应(Hypersensitive cell death response，HR)观察和拍照

1．22本氏烟转基因

2结果与分析

2．2 Sw-5b蛋白通过识别Tospovirus美洲型病毒的效应因子NSm诱导产生HR

2．3 TSWV NSm蛋白中一段21 aa的区域对诱导HR很重要

2．4 Tospovirus美洲型病毒的NSm21区域高度保守并能高效诱导Sw-5b蛋白介导的细胞死亡

2．5 Sw-5b蛋白能与NSm21互作

2．6 Sw-5b的NB-ARC-LRR能与NSm21在体外或在植物体内互作

2．7 Sw-5b的NB-ARC-LRR能与NSm21植物体内互作

2．8 R927氨基酸位点是Sw-5b维持自激活状态所必需的

2．9 Sw-5b LRR的氨基酸位点R927与NSm21之间可能存在互作

3讨论与分析

3．2 Sw-5b NLR与NSm21之间存在直接互作

3．3 NSm21与LRR的结合可能改变关键位点R927从而使Sw-5b激活

第三章我国TSWV Tsw-抗性突破株系的遗传差异分析

1材料与方法

1．1 病毒来源

1．2植物材料

1．3 引物设计

1．4摩擦接种与单斑分离

1．5寄主验证

1．6 RNA提取与反转录

1．7载体构建

1．8割胶回收

1．9胶回收产物加A

1．10加A产物与载体连接

1．12阳性筛选克隆与测序

1．13质粒提取

1．14转化农杆菌GV3101感受态细胞

1．15农杆菌处理

1．16农杆菌浸润

1．17 ELISA

1．18序列分析与系统进化树的构建

1．19 GFP荧光观察和拍照

2结果与分析

2．1 TSWV-LE能突破抗性辣椒的Tsw-抗性

2．2 TSWV-LE接种抗性辣椒的症状

2．3 我国云南地区TSWVTsw-抗性突破株系的调查

2．4 TSWV-LE能诱导抗性植物产生HR，TSWV-YN18和TSWV-YN53丧失诱导能力

2．5 TSWV-LE、TSWV-YN18和TSWV-YN53都能抑制S-PTGS和IR-PTGS

2．6 TSWV-LE、TSWV-YN18和TSWV-YN53 NSs氨基酸序列分析

2．7云南地区TSWV RB株系的系统进化起源

3讨论与分析

第四章全文总结与创新点

全文总结

创新点

参考文献

附录

致谢