多聚化合物在提高蛋白质体外正确折叠及稳定性方面的作用及相关机制研究

摘要

基因工程的迅猛发展使大规模生产基因重组蛋白质成为可能,但在蛋白药物工程化和产业化发展过程中,面临着两个关键的“瓶颈”问题。一是通过基因工程生产的重组蛋白往往以包涵体形式存在,必须经过复性才能获得最终的目的产物,纵观国内外在蛋白复性方面的研究,目前仍然以经验方法为多,产业化推广价值不大。近几年发展起来的折叠助剂促蛋白复性技术对实现蛋白高效复性创造了新的希望,但绝大多数折叠助剂与复性蛋白的结合是不可逆的,这又给后续蛋白分离纯化带来了诸多困难。二是正确折叠的功能蛋白,在实际应用过程中,常常存在稳定性差、体内半衰期短的缺陷,使得蛋白药物保存困难、临床用药频率高、治病成本高,严重制约了蛋白类药物的产业化及临床应用。围绕上述“瓶颈”问题,本文开展了两大方面的研究。
　　首先,研究一种新型折叠助剂即智能型多聚化合物Eudragit S-100是否可促进蛋白的复性,并通过与现有方法比较,得出其作用优势,再在此基础上对其作用机制开展深入的研究,具体包括:1)以溶菌酶(lysozyme)为模型蛋白,从复性蛋白活性、含量以及结构等方面研究了Eudragit S-100对溶菌酶复性促进作用。活性检测结果表明,在Eudragit S-100浓度为0.4％(w/v)时,1mg/mL浓度溶菌酶的复性回收率达到了81％,而未加EudragitS-100的对照组仅为49.7％,荧光光谱和圆二色谱分析也表明,在Eudragit S-100作用下,复性溶菌酶的结构与天然态一致。2)根据Eudragit S-100的理化特性,采用沉淀反应和离子交换实验证明了EudragitS-100对溶菌酶的促复性作用是基于两者发生了离子结合反应,进而Eudragit S-100遮蔽了溶菌酶折叠中间态的疏水基团、抑制了蛋白间疏水基团相互作用引起的聚集效应。而上述离子反应是可逆的,通过调节pH值和离子交换层析即可实现蛋白与EudragitS-100的高效分离,这无疑显示出与现有其它复性方法的优势。3)通过对作用机制的研究,本文还得出了一个有意义的推测,即Eudragit S-100仅对碱性蛋白有促复性作用。为了验证这一推测的正确性,选择了成纤维细胞生长因子(FGF)两个典型的家族成员即人酸性FGF(haFGF)和人碱性FGF(hbFGF)为模型蛋白。研究结果表明,Eudragit S-100仅对hbFGF有促复性作用,而对haFGF基无影响,这一结果很好地佐证了上述推测的正确性。此部分研究的最后又将Eudragit S-100应用到另外两种碱性蛋白,即角化细胞生长因子KGF-2和转化生长因子TGF-β1中,也得到了理想的结果。
　　本文的第二个大部分主要集中于多聚化合物20kDPEG-异硫氰酸(PIT-PEG20K)对提高蛋白稳定性的研究,具体包括:1)选择角化细胞生长因子KGF-2为模型蛋白,采用上述新型修饰制剂对KGF-2进行定位修饰。通过三因素三水平正交实验,考查了反应物摩尔比、温度和pH值等多因素对PIT-PEG20K修饰KGF-2的影响,最终确定出最佳的修饰条件为:PIT-PEG20K对KGF-2摩尔配比为9:1、反应温度为25℃、pH值为6.0;在该修饰条件下,KGF-2的修饰产率达到31.63％。通过肝素亲和层析分离方法获得了纯度超过99％的修饰蛋白PEG-KGF-2。2)对修饰的生物学性能进行了系统的研究,结果表明,修饰蛋白相比未修饰蛋白生物学活性保留了60％,热稳定性和结构稳定性均显著提高,蛋白空间结构未发生显著变化,体内半衰期由修饰前的2.6min提高到15.5min;另外,体内免疫原性也显著降低。总之,通过上述两大部分的研究,为碱性蛋白的高效复性寻求到一种崭新的方法;另外,采用PEG定位修饰的方法,成功获得了稳定性显著提高、体内半衰期显著延长的功能蛋白KGF-2。从而为解决蛋白工程化过程中面临的两大“瓶颈”问题提供了好的思路和手段。

目录

摘要

Abstract

主要缩写与符号表

引言

第一部分 多聚化合物Eudragit S-100对蛋白质体外正确折叠促进作用及相关作用机制研究

1 绪论

1.1 蛋白体外折叠机制

1.2 影响蛋白正确折叠效率的因素

1.3 蛋白复性收率常用检测方法

1.4 促进蛋白体外正确折叠的常用方法

1.5 本研究的背景及目的

1.6 总体技术路线

2 多聚化合物Eudragit S-100对溶菌酶lysozyme的促复性作用研究

2.1 引言

2.2 仪器和材料

2.3 实验步骤与方法

2.4 结果与讨论

3 多聚化合物Eudragit S-100促蛋白复性的作用机制探讨

3.1 引言

3.2 仪器和材料

3.3 实验步骤与方法

3.4 实验结果与讨论

4 多聚化合物Eudragit S-100在细胞生长因子类蛋白复性过程中的应用

4.1 引言

4.2 仪器和材料

4.3 实验步骤与方法

4.4 结果与讨论

5 本部分小结

参考文献

第二部分 聚乙二醇化学修饰对提高KGF-2的稳定性研究

1 绪论

1.1 蛋白质化学修饰的关键点

1.2 蛋白质聚乙二醇化学修饰

1.3 本研究的背景及目的

1.4 总体技术路线

2 角化细胞生长因子-2的聚乙二醇修饰及分离制备

2.1 引言

2.2 仪器和材料

2.3 实验步骤与方法

2.4 结果与讨论

3 修饰产物的生物性能及稳定性研究

3.1 引言

3.2 仪器和材料

3.3 实验步骤与方法

3.4 结果与讨论

4 本部分小结

参考文献

全文总结

1 主要研究内容及结果

1.1 多聚化合物Eudragit S—100对蛋白体外正确折叠促进作用及作用机制研究

1.2 重组人角化细胞生长因子-2的聚乙二醇化学修饰

2 创新点和特色

3 展望

致谢

博士期间发表的论文、专利及获奖情况