RNAi介导抑制MCF-7细胞中VEGF基因表达

摘要

血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是促血管生长的最关键因子之一,而血管的生成在肿瘤的生长过程中起着至关重要的作用。RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术是一种高效地、特异性地抑制目的基因表达的技术,因此利用RNAi技术抑制VEGF基因表达,可以抑制血管的生成,抑制肿瘤细胞的增殖。
　　 本实验将构建的三种靶向‘VEGF的质粒及四种化学合成的siRNA,利用阳离子脂质体转染的方法将其体外转染到人的乳腺癌MCF-7细胞中,应用细胞生物学的方法检测其抑制VEGF基因表达及抑制肿瘤细胞增殖的作用,以期为RNA干扰在肿瘤治疗方面的研究提供有效的实验依据。
　　 本论文主要通过以下几个方面对靶向VEGF的质粒及siRNA进行研究:
　　 (1)首先通过GFP标记的VEGF高表达质粒(pVEGF-GFP)转染MCF-7细胞,以转染时间、转染试剂浓度比及细胞接种密度为条件进行转染最佳条件的筛选实验;
　　 (2)将靶向VEGF的三个pSilencer质粒分别与GFP标记的VEGF高表达质粒依照最佳转染条件进行共转染,利用倒置荧光显微镜观察pSilencer质粒对’VEGF基因表达的抑制情况,利用MTT法检测pSilencer质粒对MCF-7细胞增殖的抑制情况;
　　 (3)将化学合成的四种siRNA转染MCF-7细胞,分别利用MTT、ELISA、RT-PCR检测siRNA对细胞增殖的抑制、VEGF mRNA的合成及VEGF蛋白表达抑制情况,从四种不同的siRNA中筛选得到抑制效果最好的一种siRNA;
　　 (4)将筛选得到抑制效果较好的化学合成的asiRNA21/23进行进一步研究,利用活体细胞在线培养系统、Armexin V-FITC/PI双染色及流式细胞术检测asiRNA21/23对MCF-7细胞的增殖抑制情况及其促凋亡作用。