N-琥珀酰壳聚糖载siRNA纳米粒抗肿瘤作用研究

摘要

壳聚糖是一种天然高分子化合物，是甲壳素脱乙酰基反应的产物，由于其低毒性和良好的生物相容性，近阶段逐步应用于药物载体等方面的研究。然而其较大的分子量和无规则的空间结构致使其溶解性能较差，因此在医药等领域的应用受到了限制。N-琥珀酰壳聚糖是壳聚糖的N-酰化衍生物，由壳聚糖和丁二酸酐合成而得。N-琥珀酰壳聚糖较壳聚糖溶解性能有较大改善，且具备壳聚糖在生物体内相容性好、无毒性和粘附性强等优点，因此拓宽了壳聚糖的应用范围，是一种性能优异、前景开阔的载药体介质。
　　本文首先通过乙酸/乙醇体系制备了DS为58％的N-琥珀酰壳聚糖，随后我们对合成的N-琥珀酰壳聚糖进行体外抗肿瘤的细胞活性评价，通过荧光标记N-琥珀酰壳聚糖，分别测定三种不同的肿瘤细胞MCF-7，A549，H460对N-琥珀酰壳聚糖的摄取量，并通过MTT实验测定其对肿瘤细胞增殖抑制率。我们对转染时间，转染剂量，转染细胞等条件进行了筛选，确定最终最佳的转染条件为对H460细胞以200μg/mL进行转染。
　　本文对N-琥珀酰壳聚糖进行了纳米粒子化，通过自组装法制备了具有载siRNA能力的N-琥珀酰壳聚糖纳米粒，并对其载药性能进行了研究。实验所得N-琥珀酰壳聚糖纳米粒经粒度分析后，所测得的粒径约分布在150～200nm，表面电位为+8～20mV，纳米粒体系较为稳定，TEM分析纳米粒表面形态，从透镜照片可以看出纳米粒的形态完整;通过琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度仪对N-琥珀酰壳聚糖纳米粒的载药性能进行了测试，其中以1∶1比例制得的N-琥珀酰壳聚糖纳米粒的载siRNA能力较为优秀，包封率达到了95.28％。
　　本文对载以VEGF基因为靶基因的siRNA的N-琥珀酰壳聚糖纳米粒进行了抗肿瘤作用研究，将制备的纳米粒与H460细胞进行48h，72h共孵育，随后运用MTT法，ELISA，细胞凋亡及实时定量荧光PCR对载siRNA的纳米粒进行了抗肿瘤作用测评。实验结果表明，siRNA与N-琥珀酰壳聚糖纳米粒结合后，降低了肿瘤细胞VEGFmRNA的表达量，具有良好的抗肿瘤作用，通过与脂质体载体载相同siRNA的转染效率相比较，发现N-琥珀酰壳聚糖纳米粒在72h后，转染效率要高于脂质体。

目录

声明

摘要

1．绪论

1．1．壳聚糖的性质与改性研究情况

1．1．1．壳聚糖结构性质概述

1．1．2．壳聚糖的医疗应用

1．2．N-琥珀酰壳聚糖及其纳米粒的研究概况

1．2．1．壳聚糖改性研究概况

1．2．2．N-琥珀酰壳聚糖的研究及应用

1．2．3．N-琥珀酰壳聚糖合成工艺概况及表征

1．2．4．N-琥珀酰壳聚糖纳米粒制备研究

1．3．靶向血管内皮生长因子的抗肿瘤研究

1．3．1．靶向药物载体的研究及其应用

1．3．2．血管内皮生长因子在肿瘤生长中的作用

1．3．3．肿瘤的基因治疗研究概况

1．3．4．RNAi疗法及其在抗肿瘤治疗中的应用

1．4．课题研究意义及展望

1．4．1．课题研究意义

1．4．2．展望

2．N-琥珀酰壳聚糖siRNA纳米粒的制备及性质检测

2．1．实验材料及仪器

2．2．实验方法

2．2．1．N-琥珀酰壳聚糖siRNA纳米粒的制备

2．2．2．N-琥珀酰壳聚糖siRNA纳米粒包封率测定

2．2．3．N-琥珀酰壳聚糖siRNA纳米粒电位及粒径测定

2．2．4．N-琥珀酰壳聚糖siRNA纳米粒的形态学观察

2．3．结果与讨论

2．3．1．N-琥珀酰壳聚糖siRNA纳米粒包封率测定结果

2．3．2．N-琥珀酰壳聚糖siRNA纳米粒粒径分析

2．3．3．N-琥珀酰壳聚糖siRNA纳米粒稳定性分析

2．3．4．TEM观察N-琥珀酰壳聚糖siRNA纳米粒

2．4．小结

3．N-琥珀酰壳聚糖siRNA纳米粒对不同肿瘤细胞的亲和性研究

3．1．实验材料及仪器

3．2．实验方法

3．2．1．FITC标记N-琥珀酰壳聚糖

3．2．2．标记率测定

3．2．3．细胞培养

3．2．4．N-琥珀酰壳聚糖肿瘤亲和性研究

3．3．结果与讨论

3．3．1．FITC标记N-琥珀酰壳聚糖标记率结果测定

3．3．2．N-琥珀酰壳聚糖转染肿瘤细胞状况观测

3．3．3．肿瘤细胞N-琥珀酰壳聚糖摄取率

3．4．小结

4．N-琥珀酰壳聚糖siRNA纳米粒对H460细胞抑制效应研究

4．1．实验材料及仪器

4．2．实验方法

4．2．1．MTT法检测NSC-siRNA纳米粒抑制效果

4．2．2．AnnexinV-FITC／PI双染色法研究细胞凋亡

4．2．3．ELISA检测NSC-siRNA纳米粒对细胞VEGF表达情况影响

4．2．4．荧光定量RT-PCR检测细胞VEGF基因表达情况影响

4．3．结果与讨论

4．3．1．增殖抑制率

4．3．2．细胞凋亡

4．3．3．VEGF蛋白分泌抑制

4．3．4．VEGF基因表达变化情况

4．4．小结

5．总结

5．1．结论

5．2．创新点

致谢

参考文献