冰岛硫化叶菌REY15A Cmr复合物的表达和纯化

摘要

簇状有规律间隔的短回文序列(CRISPR)被发现存在于约90％的古细菌基因组和约40％的真细菌基因组中。CRISPR序列与相关蛋白一起构成了CRISPR-Cas系统，被称为原核生物的获得性免疫系统。细菌利用CRISPR-Cas系统特异性地消除病毒、质粒等外来基因元件的威胁。因为CRISPR-Cas9系统在基因编辑方面的良好表现，CRISPR-Cas系统的研究受到了更多的关注。冰岛硫化叶菌REY15A中存在三种类型的CRISPR-Cas系统，一种CRISPRⅠ A型，两种是只存在于古细菌中的CRISPRⅢ B型。人们对它们相关的Cas蛋白复合物的结构和功能尚不清楚。为了获得Ⅲ B型CRISPR系统的Cas蛋白复合物——Cmr复合物，我们利用大肠杆菌-冰岛硫化叶菌穿梭质粒pSeSD构建了带有Cmr蛋白亚基Cmr3的表达载体。将该质粒转化到冰岛硫化叶菌中，通过阿拉伯糖诱导，在冰岛硫化叶菌E233S（REY15A的尿嘧啶缺陷型）中表达出带His标签的Cmr3蛋白。由于Cmr复合物各亚基之间的相互作用，可以通过His标签纯化出Cmr复合物。

目录

声明

摘要

符号与缩略语说明

1 绪论

1．1 古细菌概述

1．2 硫化叶菌概述

1．2．1 硫化叶菌的形态学特征

1．2．2 硫化叶菌的代谢

1．2．3 硫化叶菌的DNA复制、转录和翻译

1．3 冰岛硫化叶菌的分类和性质

1．4 CRISPR-Cas系统

1．4．1 基因编辑技术和CRISPR-Cas系统

1．4．2 微生物的获得性免疫系统

1．4．3 细菌CRISPR系统的分类

1．5 Cmr复合物

1．6 研究的目的和意义

2 材料和方法

2．2．1 培养基母液的配制

2．2．2 液体培养基

2．2．3 固体培养基

2．2．4 冰岛硫化叶菌的培养条件

2．2．5 大肠杆菌的培养条件

2．3 试剂和仪器

2．3．1 工具酶

2．3．2 化学试剂和分子生物学试剂

2．3．3 试剂盒和公司服务

2．3．4 缓冲溶液的配制

2．3．5 实验涉及的仪器设备

2．4 分子克隆实验设计

2．5 分子克隆实验方法

2．5．1 冰岛硫化叶菌基因组的提取

2．5．2 大肠杆菌和硫化叶菌质粒提取

2．5．3 琼脂糖凝胶电泳实验

2．5．4 DNA的琼脂糖凝胶回收

2．5．5 大肠杆菌感受态细胞的制备

2．5．6 大肠杆菌感受态细胞的转化

2．5．7 硫化叶菌感受态细胞的制备、电转化和筛选

2．6 硫化叶菌细菌的大量培养

2．6．1 仪器介绍

2．6．2 硫化叶菌的发酵培养操作

2．6．3 发酵条件的调试

2．6．4 冰岛硫化叶菌表达菌株的生长曲线

2．7 蛋白实验方法

2．7．1 冰岛硫化叶菌细胞破碎

2．7．2 聚丙烯酰胺凝胶电泳

2．7．3 蛋白质免疫印迹实验

3 结果与讨论

3．1 分子克隆实验结果

3．1．1 PCR实验和目的基因回收

3．1．2 酶切实验和连接反应

3．1．3 冰岛硫化叶菌的转化和筛选

3．2 蛋白的表达纯化

3．2．1 Cmr蛋白的表达

3．2．2 Cmr复合物的纯化

4 总结和展望

致谢

参考文献