分子改造方法提高大肠杆菌天冬氨酸转氨酶热稳定性的研究

摘要

酶具有反应活性高、专一性强、反应条件温和的特点，因而被广泛应用于工业和医药领域。但是它自身稳定性差和来源有限等缺点，限制了它进一步的开发和利用，所以需对天然酶分子改造，以满足实际应用的需要。目前通过分子改造来改善酶的性质是生物技术研究的一个热点方向。
　　 天冬氨酸转氨酶是一类广泛存在于生物细胞内的转氨酶，在氮代谢中起到非常重要的作用。它可催化转化底物苯丙酮酸生产重要的医药、食品工业原料-L-苯丙氨酸。在生产L-苯丙氨酸的工艺中，如能提高反应温度，则可增加底物苯丙酮酸的溶解度、加快草酰乙酸的分解进而显著提高L.苯丙氨酸的得率。而天冬氨酸转氨酶无法在较高温度的条件下反应，是当前工业生产L-苯丙氨酸的瓶颈之一。
　　 大肠杆菌和嗜热菌天冬氨酸转氨酶的结构比较显示了两者在酶分子表面、酶亚基之间和酶整体结构上的明显差异。本文从上述三个方面的结构差异与酶热稳定性间的关联出发，分别建立了合理设计方法，半合理设计方法和定向进化方法对天冬氨酸转氨酶分子进行改造，获得了5种耐热性提高的天冬氨酸转氨酶，初步建立了酶分子改造的技术平台。本文的主要内容包括3个方面。
　　 (1)采用合理设计方法改造天冬氨酸转氨酶
　　 本文分析了大肠杆菌天冬氨酸转氨酶表面loop环上氨基酸组成的特点，比较了大肠杆菌和嗜热菌天冬氨酸转氨酶的组成，选择了酶分子表面的疏水氨基酸L233和F350进行L233N和F350K的定点突变。在55℃条件下初始酶的半衰期为140min，疏水氨基酸L233替换成亲水氨基酸N233后，形成的突变酶Enz N233的半衰期则延长至180min，疏水氨基酸F350替换成亲水氨基酸K350后，形成的突变酶Enz K350的半衰期则降低至30min。这些研究工作采用突变大肠杆菌天冬氨酸转氨酶分子表面loop环上疏水氨基酸的方法，从而建立起一种获得热稳定性AspAT的简易方法。
　　 (2)采用半合理设计改造天冬氨酸转氨酶
　　 分析了天冬氨酸转氨酶亚基的结构、亚基间的相互作用与酶热稳定性的关系，选择了位于亚基之间的残基--19、T10、A12、R282、S285和Q286作为随机突变的位点，构建了天冬氨酸转氨酶的基因突变库。从构建的突变文库4000株突变菌中获得了4种耐热性明显提高的突变酶(C1、C2、C3和C4)。这些突变酶在55℃条件下的半衰期都在840min以上，其中一种突变酶在37℃下的催化活性为野生型酶的87.9％。这些研究工作将合理设计方法和分子定向进化方法结合起来，从而建立起一种增强天冬氨酸转氨酶亚基间作用力来提高酶热稳定性的方法。
　　 (3)采用定向进化改造天冬氨酸转氨酶分子的初步探索
　　 根据现有的天冬氨酸转氨酶家族基因aspC和tyrB序列同源性不高的特点，结合限制性内切酶的酶切片段间同源重组和非同源随机重组过程，构建了突变文库。通过选择不同酶切片段的组合，使酶切的位点处于基因aspC和tyrB同源性高的14个区域内，且不同酶切位点间距离大于20bp，使最终突变文库中的基因重组几率高达66％。通过控制酶切片段在PCR重组时的退火温度和反应循环数，适当地增加基因片段间的非同源随机重组，提高了突变库的突变率。测序结果表明，突变库中的重组基因除含有aspC和tyrB基因间的片段交换。这些天冬氨酸转氨酶突变文库的研究工作可为该酶进行功能改良或新功能的进化提供新的酶源，同时也为进一步完善酶分子改造的技术平台进行了有益的探索。
　　 本文的研究工作首次用酶改造的方法提高了天冬氨酸转氨酶的热稳定性，获得了5种热稳定性提高的天冬氨酸转氨酶，并对建立该酶分子改造的技术平台进行了系统的探索。
　　 (1)本文提出并建立了基于亚基间相互作用来选择定位随机突变位点的半合理设计方法。此方法有效实现了天冬氨酸转氨酶分子的改造工作，所获得的4种突变酶在55℃下的半衰期比初始酶延长5.6倍，其中一种热稳定性最高的酶(C5)在60℃下的半衰期比初始酶延长16倍。4种突变酶和初始酶的结构比较发现，突变酶的突变残基，或者形成氢键网络结构(例如在突变酶C5、C12中)，或者通过色氨酸残基的疏水环来增强了残基间的疏水作用(例如在突变酶C2、C4、C5中)。这些作用的增强提高了亚基间的结合力，从而提高酶的热稳定性。另外分析突变酶的结构还发现，酶表面的残基发生突变后，会引起酶活性中心残基W140、N297*、R292和R386与底物距离产生变化，造成了酶与底物间结合作用力发生改变，从而导致了突变酶对底物亲和能力发生变化。
　　 (2)本文针对天冬氨酸转氨酶分子表面的结构特点，建立了一种定点突变改造天冬氨酸转氨酶分子的简易方法。这个方法可根据热稳定性不同酶中氨基酸残基组成的差异来设计定点突变的路线。分析获得的突变酶Enz N233的结构发现，酶表面loop上氨基酸残基N233的亲水性增加是酶热稳定性提高的主要原因，突变残基N233和邻近α-螺旋上残基E320间相互作用的增强，也可能是酶耐热性提高的原因之一；酶定点突变后还获得了一个热稳定性降低的反例一突变酶Enz K350，对其结构分析发现，邻近突变残基周围，若有电性相同的氨基酸残基，将可能突变残基排斥到酶分子的内部，造成了酶热稳定性的下降。
　　 (3)本文还结合同源重组和非同源随机重组，探索了定向进化中突变文库的构建方法。这个方法在酶切片段的同源重组中，增加了非同源随机重组的过程，即克服了基因间同源区较少而造成同源重组突变率较低的局限，又保留了酶切片段在同源重组中重组几率高的优点。通过控制重组PCR的条件(退火温度和PCR循环数)，可以优化突变库中的突变率，增大获得较优突变体的可能性；对酶切片段的选择，又提高了突变后基因的重组几率，有利于减少后期筛选的工作量。