海因-天冬氨酸转氨酶法制备非天然L-苯丙氨酸类似物的研究

摘要

非天然氨基酸已广泛用于手性模块、构象约束和药物活性产品开发，许多非天然氨基酸是药物和潜药的关键组分。L-苯丙氨酸类似物作为一类非常重要的非天然氨基酸而正受到广泛关注，他们中有些就是临床药物，还有一些是许多药物及先导药物的关键中间体。
　　 本文首次对各种L-苯丙氨酸类似物的生理活性、用途及制备方法进行了较全面的综述。在系统分析总结和本课题组研究工作基础上，开发了海因-天冬氨酸转氨酶法制备L-苯丙氨酸类似物的方法，即采用化学合成法合成前体海因，随后以海因为原料经5-不饱和取代海因合成系列芳基取代丙酮酸，最后通过天冬氨酸转氨酶催化制备系列L-苯丙氨酸类似物，并首次采用量子化学计算方法解释了天冬氨酸转氨酶底物选择性差异产生的原因。通过构建多酶反应体系，初步研究了应用多酶体系制备L-4-氟苯丙氨酸。
　　 本文主要技术创新及理论成果如下：
　　 1)采用填料塔反应器和滴流床反应器以二氧化碳、氨气和羟基乙腈为原料成功制备了平台化合物海因。采用自制填料塔反应器优化了以两种气体为原料制各海因的条件，具体如下：采用L2型拉西环乱堆填料，填料量150 g，气液两相采用逆流方式进料，NH3通入速度为0.2 m3·h-1，通入时间约1 h左右，CO2则在整个反应过程中一直保持0.3 m3·h-1的速度通入，液相进料速度在135-180mL·h-1之间，夹套加热温度控制在80-100℃之间，海因最高收率为69.4％。通过对滴流床反应器制备海因过程中的几个重要反应参数进行初步的摸索，得出的最适条件为：采用S3型强酸性阳离子交换树脂替代原先的惰性磁环作为填料和催化剂，填料量200 g，填料高度约为反应器高度的2/3，气液两相采用逆流方式，混合气体气速0.5 m3·h-1，液相进料速度在150 mL·h-1左右，夹套的加热温度控制在100℃左右，海因最高收率为65.8％。
　　 2)采用常规条件和微波辅助研究了系列5-不饱和芳基取代海因的合成和碱解过程。通过研究5-不饱和芳基取代海因常规条件和微波辅助下的合成过程，结果发现4-氟亚苄基海因、4-氯亚苄基海因、呋喃亚甲基海因、3，4-二羟基亚苄基海因、2-羟基亚苄基海因和4-甲氧基亚苄基海因常规合成的最适物料配比分别为1.4:1、1.1:1、1.4:1、1.3:1、1.3:1和1.1:1：最适催化剂用量分别为1.2 mL、1.8 mL、1.0 mL、1.2 mL、1.4 mL和1.4 mL；最适反应时间为90 min、90 min、105 min、105 min、105 min和105 min。微波辅助下，4-氟亚苄基海因、4-氯亚苄基海因、呋喃亚甲基海因、3，4-二羟基亚苄基海因、2-羟基亚苄基海因和4-甲氧基亚苄基海因合成的最适功率分别定为P5、P3、P4、P3、P5及P3；最适反应时间分别为50 min，45 min，35 min，50 min，35 min和20 min。此外，采用单晶X-射线衍射对3-氟亚苄基海因和4-氟亚苄基海因的晶体结构进行了解析。
　　 在研究5-不饱和芳基取代海因常规条件和微波辅助下碱解制备芳基取代丙酮酸的过程中，结果发现常规条件下4-氟亚苄基海因、2-羟基亚苄基海因、4-甲氧基亚苄基海因和3，4-二羟基亚苄基海因与氢氧化钠的最适物质的量分别为1:4、1:5、1:4和1:3；最适底物浓度分别为40 g·L-1、40 g·L-1、60 g·L-1和80 g·L-1；碱解时间分别为80 min、80 min、110 min和70 min。微波辅助下4-氟亚苄基海因、2-羟基亚苄基海因、4-甲氧基亚苄基海因和3，4-二羟基亚苄基海因与氢氧化钠的最适物质的量分别为1:4、1:4、1:4和1:3；最适功率分别为P4、P4、P6和P4；最适反应时间分别为27 min、22 min、25 min和12 min。
　　 通过比较，发现微波可以明显加快5-不饱和芳基取代海因的合成和碱解反应速度，但反应收率未见明显提高。但同时我们可以看出，微波辅助对5-不饱和芳基取代海因的碱解过程加速明显，这对于高温下长时间加热不稳定的芳基取代丙酮酸制备是一个很好的手段。
　　 3)优化了产天冬氨酸转氨酶的重组E.coli BL20-pET/aspC的发酵产酶条件。通过对重组E.coli BL20-pET/aspC的摇瓶发酵条件的优化，得到的廉价高效的以玉米浆为主要营养物的发酵培养基组成如下：玉米浆45 mL·L-1，酵母粉2 g·L-1，淀粉2 g·L-1，NaCl1 g·L-1。菌种摇瓶发酵工艺优化条件为：温度37℃，转速180rpm，pH7.0，装液量40 mL/250 mL摇瓶，种子液培养时间8 h，接种量3％。
　　 4)利用天冬氨酸转氨酶催化成功制备了14个非天然L-苯丙氨酸类似物，其中有些为首次采用该法制备。首先以重组E.coli BL21-pET/aspC所产天冬氨酸转氨酶为催化剂，研究了天冬氨酸转氨酶法制备L-4-氟苯丙氨酸的工艺，优化了反应条件。结果如下：温度37℃，pH值范围5.0-8.0，菌体用量为菌体与4-氟苯丙酮酸质量浓度比为5.63，4-氟苯丙酮酸的质量浓度7 g·L-1，n(L-天冬氨酸)/n(4-氟苯丙酮酸)为1.6。在最适条件下，经过12 h酶转化反应达到平衡，4-氟苯丙酮酸转化率可达到90％以上，L-4-氟苯丙氨酸产率也可达到85％以上。随后，将上述过程推广用于其他L-苯丙氨酸类似物的制备研究，并制备了14种非天然L-苯丙氨酸类似物。
　　 5)通过对芳基取代丙酮酸的量子化学计算分析，从一个全新的角度剖析了天冬氨酸转氨酶催化转氨反应过程中产生底物选择性差异的原因。通过采用量子化学计算，对芳基取代丙酮酸总能量、羰基氧原子净电荷分布及前沿分子轨道进行分析，得出了上述参数与芳基取代丙酮酸反应活性的关系，通过与实验结果比较，发现两者还比较吻合，从而在一定程度上可解释天冬氨酸转氨酶催化转氨反应过程中产生底物选择性差异的原因。
　　 6)以pET22b为载体，成功构建了来源于Candida boidinii的甲酸脱氢酶高表达E.coli菌株。经过酶活测定，含有质粒pET-fdh的重组菌经诱导8 h所表达的甲酸脱氢酶酶活为0.1μmol·min-1·mL-1。通过SDS-PAGE发现，甲酸脱氢酶在E.coli中得到了大量高效的表达。
　　 7)利用所构建的甲酸脱氢酶、谷氨酸脱氢酶和天冬氨酸转氨酶多酶偶联的辅酶再生反应体系进行了L-4-氟苯丙氨酸制备的初步研究。优化了反应条件，结果如下：天冬氨酸转氨酶，100μL；谷氨酸脱氢酶，5μL；甲酸脱氢酶，15μL；4-氟苯丙酮酸，0.5 g·L-1；n(4-氟苯丙酮酸)：n(甲酸铵)，1:1；n(α-酮戊二酸)/n(甲酸铵)，1％；温度，34℃；pH，7.5。