酶法合成γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸

摘要

γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸(γ-L-glutamyl-L-cysteine，GGC)，是由L-谷氨酸、L-半胱氨酸经肽键缩合而成的一种同时含有γ-谷氨酰基和巯基的具有生物活性的二肽化合物，是生物体内非蛋白巯基化合物--谷胱甘肽(GSH)的前体，其功能与GSH类似。但由于GGC可被很多细胞直接吸收，在提高胞内GSH水平方面，GGC较直接供给GSH或半胱氨酸更为有效。因此，GGC在医药、食品及化妆品等领域具有广泛的应用前景。
　　 在生物体内GGC的合成是由γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(GSH I，EC6.3.2.2)催化的。但由于反应过程需要消耗大量ATP，利用该法在体外合成GGC难以实现工业化生产。针对以上情况，本论文采用枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis NX-2发酵获得的γ-谷氨酰转肽酶(γ-glutamyltranspeptidase，GGT)为催化剂，以L-谷氨酰胺(Gln)和S-苄基-L-半胱氨酸(S-Bzl-cys)为底物进行酶促转肽反应合成S-苄基-γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸(S-Bzl-GGC)，再经三氟甲磺酸脱除苄基得到产物GGC。
　　 研究的主要内容包括：
　　 (1)催化反应机理的研究及反应网络的分析。利用质谱对酶促反应合成S-Bzl-GGC体系中的水解、自转肽及产物水解等副反应进行定性分析，解析反应网络结构。实验结果表明，GGT不仅参与了转肽反应，而且可催化γ-谷氨酰供体的自转肽反应和产物的水解反应。作为本研究的目的产物S-Bzl-GGC只是转肽-水解这一级联反应的中间产物，对于反应过程的控制提出了很高的要求。
　　 (2)反应体系中GGT的最适催化条件及催化动力学参数的确定。研究表明在实验研究体系中，GGT的最适作用pH值为9～10，最适作用温度为40℃；GGT对Gln作为供体的亲和力常数为Km1=4.17mmol·L-1，转肽反应的催化常数为Kcat1=2717min-1；GGT对S-Bzl-GGC的亲和力常数为Kna=9.54 mmol·L-1，水解反应的催化常数为Kcat2=3168min-1，自转肽反应中Gln作为受体与GGT的亲和力常数Km3=10.87mmol·L-1，自转肽反应的催化常数为Kcat3=1773min-1。
　　 (3)酶法合成S-Bzl-GGC工艺的初步研究。实验结果表明，在受体浓度不变的条件下，提高Gln浓度有利于提高产物得率，但供体转化率却随之下降。此外，在转化过程中产物积累达到最大值所需时间随酶量变化明显。增加酶浓度有利于提高反应速率，但对反应平衡无影响。当供体、受体浓度均为20mmol·L-1，酶浓度为0.0208U·mL-1时，在pH9.0，40℃条件下反应3h，反应液中S-Bzl-GGC浓度可达5.14 mmol·L-1，此时供体转化率为25.7％。由于Gln在反应过程中不仅可作为谷氨酰供体，同时也可以作为受体(自转肽)，因此Gln的不同投料方式对转化过程的影响较大，采取分批投料方式可有效减弱自转肽反应，提高产物得率和底物转化率。
　　 (4)S-苄基-γ-谷氨酰半胱氨酸的纯化表征。酶促反应产物经过DEAE离子交换层析和C18反相制备色谱(RPC)纯化后，纯度可达到98.3％，利用核磁共振氢谱确定反应产物的结构为S-Bzl-GGC。
　　 (5)S-Bzl-GGC脱保护工艺条件优化。以三氟甲磺酸(F3CSO3H)为脱保护试剂，确立了最优反应条件：在温度40℃，固(S-Bzl-GGC)/液(F3CSO3H)=1/100(g/mL)条件下，反应时间30分钟，苄基脱除率可以达到75％左右。过高的温度，过长的反应时间以及过多的酸用量均会导致产物收率下降。
　　 (6)GGC的纯化表征。反应产物经过C18 RPC制备色谱纯化后纯度达到了94.1％，通过核磁共振氢谱确定反应产物的结构为GGC。