嗜冷细菌△9脂肪酸脱氢酶的基因克隆与功能研究

摘要

脂肪酸脱氢酶是生物体合成不饱和脂肪酸的关键酶之一，也是生物调节细胞膜组成与功能的重要酶，其研究日益受到重视。从动物、植物、真菌和藻类等不同生物体中克隆到脂肪酸脱氢酶基因，并获得了功能性表达，但细菌来源的脂肪酸脱氢酶相关研究很少。本文筛选了土壤嗜冷细菌，研究了嗜冷细菌的分布及脂肪酸组分特征、嗜冷细菌△9脂肪酸脱氢酶的基因克隆与表达、酶相关性质、酶系统进化与功能性氨基酸残基鉴定等。
　　 采用15℃的培养条件，从低温环境下的土壤样品中富集并分离到32株嗜冷细菌，其中革兰氏阳性菌6株，革兰氏阴性菌26株。根据细胞脂肪酸组成的多样性，选择具有代表性的11株细菌进行菌种鉴定与分类，它们分布在Psychrobacter、Pseudomonas、Pseudochrobactrum、Sphingobacterium、Arthrobacter、Bacillus和Pseudoalteromonas等7个属。除1株只能鉴定到属外，其余10株均可鉴定到种。革兰氏阳性菌细胞脂肪酸中C15支链饱和脂肪酸的含量高于90％；革兰氏阴性菌脂肪酸的不饱和度均超过50％，主要含不饱和的C16或C18直链脂肪酸，揭示了革兰氏阳性菌和阴性菌不同的细胞膜脂肪酸组分的低温适应机制。总结以上结果，本研究选择了高不饱和脂肪酸含量的海洋嗜冷细菌Pseudoalteromonas haloplanktis M15及嗜冷细菌Psychrobacter urativorans DSM14009作为脂肪酸脱氢酶基因的供体菌。
　　 采用CODEHOP PCR策略和改良的基因组步移方法快速高效地从Psy。urativorans DSM14009中克隆了△9脂肪酸脱氢酶的编码基因PuFAD9(GenBankaccession no.EF617339)。该基因的氨基酸序列与Psychrobacter arcticus273-4推测的△9脂肪酸脱氢酶具有79％一致性，具有整膜脱氢酶特征性的疏水分布和三个组氨酸富集区。将PuFAD9基因转化E.coli并诱导表达，目的蛋白的N端融合有T7 tag，其分子量大约为60 kDa，主要定位于细胞膜。它具有△9脂肪酸脱氢酶活性，能催化细胞中棕榈酸转化为棕榈油酸。在15℃下表达，重组菌C16脂肪酸中棕榈油酸含量由34％增加到88％，而棕榈酸含量由66％减少到12％。另外显示培养温度显著影响细胞中不饱和脂肪酸的含量，25℃下诱导表达6 h，重组菌中棕榈油酸与棕榈酸的比率是15℃下表达的2.4倍，与该酶在两个温度下的表达水平一致。表明温度影响脂肪酸脱氢酶的合成，从而影响棕榈酸到棕榈油酸的转化。37℃下尽管有蛋白表达条带，但没有观察到棕榈油酸的积累，很可能因为较高温度下，脂肪酸脱氢酶的折叠可能受到影响。在25℃下诱导4 h，脱氢酶的蛋白表达量和in vivo活性最大。
　　 从嗜冷海洋细菌Pseu.haloplanktis M15中克隆到脂肪酸脱氢酶基因PhFAD9。该基因的一级序列与Pseu.haloplankits TAC125推测的脂肪酸脱氢酶序列(Genbank accession no.YP_341374)同源性高达99.7％，其第304个氨基酸由赖氨酸K突变为精氨酸R。系统发育分析证明该序列与其他海洋细菌的脂肪酸脱氢酶推测序列也具有很高的同源性。用HMMTOP、TMHMM、DAS、TMpred、SOSUI、TopPred和Phobius等七种在线软件对其进行了跨膜螺旋预测。用Phobius软件分析得到的Pseu.haloplanktis脂肪酸脱氢酶的膜拓扑学模型，与文献报道的其他整膜脱氢酶的膜拓扑学模型一致。PhFAD9基因在E.coli中表达的蛋白产物具有△9脂肪酸脱氢酶活性。25℃下诱导2 h后，重组菌C16脂肪酸的不饱和度达到91.7％，增加为对照菌中的近两倍，棕榈油酸与棕榈酸的比率由对照菌中的0.9提高到11。
　　 来源于Psy.urativorans DSM14009和Pseu.haloplanktis M15的△9脂肪酸脱氢酶都能利用棕榈酸和硬脂酸为底物，且更适于转化棕榈酸。硬脂酸并非E.coli宿主的主要内源脂肪酸组分，培养基中预先加入400μmol·L-1硬脂酸的条件下，在重组菌PuFAD9和PhFAD9的细胞总脂肪酸(硬脂酸除外)中分别检测到4.3％和2.0％的油酸，显示该类酶对硬脂酸的活性可能较低。
　　 比对了已报道的功能确定的整膜△9脂肪酸脱氢酶的氨基酸序列，除蓝细菌的第三个组氨酸富集区最后一个氨基酸残基为酪氨酸Y，这类酶三个保守的组氨酸富集区特征为HRXXXH，XWXXXHRXHH，HNXHHXF。以蓝细菌中A9脂肪酸脱氢酶作为外群，采用邻近连接法构建系统进化树。△9脂肪酸脱氢酶主要分为蓝细菌、植物、细菌、真菌和动物△9脂肪酸脱氢酶等5个单系群。确立了细菌脂肪酸脱氢酶的进化地位，对该类酶的深入研究具有一定的指导意义。
　　 根据多序列比对结果，将Psy.urativorans脱氢酶序列中功能未被验证的保守残基G212、H217、W220和S297分别突变为H，N，G和K。25℃下诱导表达4 h后，用SDS-PAGE和蛋白印迹方法检测到Psy.urativorans△9脱氢酶和其突变酶都有表达。在培养基中添加或不加硬脂酸的条件下，表达野生酶的重组菌细胞脂肪酸中棕榈油酸的含量分别为22％和26％，是棕榈酸的1.5和1.8倍。而突变株的棕榈油酸与棕榈酸组成与不含脂肪酸脱氢酶基因的对照株接近。在添加硬脂酸培养的野生酶重组菌中还能检测到4％的油酸，但从突变酶重组菌中未检出油酸。表明G212H，H217N，W220G和S297K四处单点突变都能导致Psy。urativorans△9脂肪酸脱氢酶失活，说明G212、H217、W220和S297与该酶的结构或功能密切相关。