腺病毒介导人HIF-1α基因在急性心梗后的表达及对缺血心肌干预治疗远期结果的实验研究

摘要

目的： 研究腺病毒介导的人低氧诱导因子-1 α(Hypoxia indtJcible factor l α，HIF-1 α)基因在急性心梗模型中能否被有效转染，心肌细胞凋亡变化以及HIF-1 α的上下游基因细胞外信号调节蛋白激酶(extracellular signaI-regulatedkinase，ERK)、磷酸化细胞外信号调节蛋白激酶(p-ERK)，血管内皮生长因子(VaSCular endothelial growth factor，VEGF)在长期缺血心肌中的表达，以此为基础探讨腺病毒介导HIF-1 α转基因治疗在心肌缺血中可能的分子机制及其发挥作用的时间窗，并以HIF-1 α核酶基因进行干预从而证明HIF-1 α在缺血心肌保护中发挥重要作用。 方法： 普通级成年健康新西兰白兔120只，体重2-2．5kg，雌雄不拘，随机分为4组，每组30只。①假手术组(Sham组)：开胸后，只穿线不结扎。②不含HIF-l α腺病毒载体转染组(Ad-Blank组)：结扎后心肌内注射不含目的基因的病毒颗粒溶液8 μ I。⑧含HIF-1 α腺病毒载体转染组(Ad-HIF-l α组)：结扎后心肌内注射含目的基因的病毒颗粒溶液8 u l(Ad-HIF-l α滴度为1×10<’13>PFU／m1)。④腺病毒介导的HIF-1 α核酶基因干预组(Rz-HIF-l α组)：结扎后心肌内注射HIF-1 α核酶基因8μl(Rz-HIF-1 α滴度为1×10<’13>PFU／m1)。 模型制备成功后常规饲养，于l、7、14、28、56天分别取材分为5个亚组，每组6只。动物取材时经左心室心尖部插管，连接于Maclab／8s多功能生理仪，监测左心室功能。各组于相应时间点，麻醉后取样，Sham组取左冠状动脉前降支支配末梢部位心肌，其余各组取左心室梗死边缘缺血区心肌组织，分别于液氮中保存和4％戊二醛、10％福尔马林中固定，用RT-PCR方法检测HIF-1α和VEGF的mRNA表达，末端原位标记(TUNEL)法检测心肌细胞凋亡。对于56天长期缺血的各组心肌，透射电镜观察心肌组织超微结构形态学变化，免疫组化方法观察HIF-lα及其上游ERK、p-ERK，下游VEGF蛋白的定位情况。免疫印迹(Western blot)法定量检测HIF-1α、ERK、p-ERK、VEGF蛋白表达情况。 结果： l、HE染色的光镜及电镜结果证实载体注射、取材部位是心肌梗死边缘缺血心肌。 2、RT-PCR结果显示，术后l天、7天、14天、28天均有外源性HIF-1αmRNA的表达，56天时已基本无表达，其中7天时HIF-1αmRNA表达较l天、14天、28天明显增多(P<0.05)；VEGFmRNA在Ad-BLANK组、Ad—HIF-1α组和Rz-HIF-1α组均有表达，其中Ad-HIF-1α组较其他组表达明显增多(P<0.05)，Rz-HIF-1α组表达最少。VEGFmRNA的表达7天达高峰，7天时的表达较其他各时间点明显增多(P<0.05)。 3、TUNEL法检测心肌细胞凋亡，Sham组基本无凋亡细胞，Ad-HIF-1α组各时间点的细胞凋亡数较Ad-Blank组明显减少(P<0.05)；Rz-HIF-1α组各时间点的细胞凋亡数较Ad-Blank组明显增多(P<0.05)。在各个时间点中，术后1天凋亡细胞最多，7天、14天凋亡细胞逐渐减少，28天和56天的凋亡细胞数最少，且二者之间无显著性差异(P>0.05)。 4、血流动力学结果显示Shaam组LVDP、±dp／dt<,max>最高，Rz-HIF-1α组最低。各个时间点其他各组LVDP、±dp／dt<,max>较Sham组明显下降(P<0.05)；在7天、14天、28天、56天，Ad-HIF-1a组较Ad-Blank组升高(P<0.05)，Rz-HIF-1a组较Ad-Blank组下降(P0.05)，p-ERK无表达；VEGF蛋白的表达Ad-HIF-1a组、Ad-Blank组、Rz-HIF-la组较Sham组有显著性差异(P<0.05)。 结论： 1、腺病毒介导人HIF-1a基因转染入缺血心肌后，RNA水平检测到外源HIF-1a基因及其下游基因VEGF的表达，目的基因被有效转录并激活。 2、HIF-la基因有效转染后能够明显减少心肌细胞的凋亡，改善心功能参数，并且未观察到不良反应。 3、腺病毒介导人HIF-la基因对长期缺血心肌无持续作用，其发挥作用的时间窗为心肌缺血急性期至亚急性期。 4、腺病毒介导的HIF-la核酶基因抑制HIF-la及其下游基因的表达，使心功能恶化，证实了HIF-1a的保护作用。

目录

缩略词表

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材料和方法

实验结果

讨论

结论及创新之处

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参考文献

综述低氧诱导因子-1及其转基因治疗缺血性心脏病研究进展

攻读硕士学位期间发表学术论文题目

致谢

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