盐酸戊乙奎醚对大鼠海马脑片缺氧缺糖/复氧复糖损伤的保护作用

摘要

目的: 研究盐酸戊乙奎醚（Penehyclidine hydrochloride，PHC）对大鼠海马脑片缺氧缺糖/复氧复糖损伤（Hypoxia/Hypoglycemia and Reperfusion Injury，H/R）的保护作用及作用机制，旨在为拓宽该药临床用途提供科学的依据。
　　 方法:
　　 1.PHC对大鼠海马脑片缺氧缺糖/复氧复糖损伤的保护作用
　　 采用大鼠海马脑片缺氧缺糖/复氧复糖损伤模型。设正常（Control）组、缺氧缺糖/复氧复糖损伤（H/R）组、PHC 2μmol·L-1（PHC 2）组、PHC10 μmol·L-1（PHC 10）组、PHC50 μmol·L-1（PHC 50）组。测定脑片孵育液中LDH释放率；脑片分别进行TTC染色计算组织损伤百分率，HE染色观察组织病理形态学变化。
　　 2.PHC对大鼠海马脑片缺氧缺糖/复氧复糖损伤的保护作用机制探讨
　　 采用大鼠海马脑片缺氧缺糖/复氧复糖损伤模型。设正常（Control）组、缺氧缺糖/复氧复糖损伤（H/R）组、PHC50 μmol·L-1（PHC）组、盐酸东莨菪碱50μmol·L-1 (Sco) 组。免疫印迹法测定pERK1/2、cPLA2蛋白表达量；高效液相色谱（HPLC）法测定脑脊液中氨基酸的含量；免疫组织化学法测定海马CA1区pERK1/2、Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表达量。
　　 结果:
　　 1.PHC对大鼠海马脑片缺氧缺糖/复氧复糖损伤的保护作用
　　 1.1 PHC对缺氧缺糖/复氧复糖损伤的大鼠海马脑片LDH释放率的影响H/R组LDH释放率为42±5.8％，高于Control组9.2±1.1％（P<0.01）。与H/R组相比，PHC2、PHC10、PHC50组LDH释放率均降低，分别是H/R组的76.2％、61.9％（P<0.01）、47.6％（P<0.01)，且该作用呈剂量依赖性（rs=-0.866, P<0.01）。提示PHC能够降低LDH释放率，减轻缺氧缺糖/复氧复糖所致的大鼠海马脑片损伤。
　　 1.2 PHC对大鼠海马脑片缺氧缺糖/复氧复糖损伤后TTC染色OD490的影响
　　 H/R组TTC染色OD490为0.33±0.02，较Control组1.00 ±0.07明显下降(P<0.01)，组织损伤百分率为66±5.3％。PHC3个剂量组均能显著提高缺氧缺糖/复氧复糖海马脑片的TTC染色后的OD490，分别是H/R组的1.2倍( P<0.05）、1.6倍（P<0.01）和2.1倍（P<0.01)。而组织损伤百分率显著降低，为H/R组的93.9％、71.2％（P<0.01）、47.0％（P<0.01)，且该作用呈剂量依赖性（rs=-0.944, P<0.01）。提示PHC能明显降低大鼠海马脑片组织损伤百分率。
　　 1.3 PHC对大鼠海马脑片缺氧缺糖/复氧复糖损伤后组织病理形态学的影响Control组海马CA1 区结构正常,锥体细胞排列整齐、紧密；H/R组海马CA1 区已失去正常结构,锥体细胞部分丧失, 残存细胞大多数不正常,可见细胞肿胀，核深染，核固缩、碎裂、溶解，胞浆嗜伊红；PHC50组海马CA1 区结构较完整，正常细胞与H/R组比较均明显增多，损伤的细胞相对较少。提示PHC能减轻缺氧缺糖/复氧复糖所致的细胞损伤。
　　 2. PHC对大鼠海马脑片缺氧缺糖/复氧复糖损伤的保护作用机制探讨
　　 2.1 PHC对大鼠海马脑片缺氧缺糖/复氧复糖损伤后pERK1/2表达的影响
　　 免疫印迹分析表明，H/R组pERK1/2蛋白的表达显著高于正常组（P<0.01）；PHC组、Sco组pERK1/2蛋白表达量则降低（P<0.01），并且PHC组pERK1/2蛋白表达量低于Sco组（P<0.01）。免疫组织化学结果同样表明，在海马脑片CA1区，PHC、Sco能降低H/R后pERK1/2蛋白表达量（P<0.01），且PHC组的pERK1/2蛋白表达量低于Sco组（P<0.01）。
　　 2.2 PHC对大鼠海马脑片缺氧缺糖/复氧复糖损伤后cPLA2表达的影响免疫印迹分析表明，H/R组cPLA2蛋白表达量较Control组明显增多（P<0.01）; PHC组、Sco组cPLA2蛋白表达量较H/R组明显降低（P<0.01），且PHC组低于Sco组（P<0.05）。
　　 2.3 PHC对大鼠海马脑片缺氧缺糖/复氧复糖损伤后孵育液中氨基酸含量的影响H/R组海马脑片孵育液中Asp、Glu浓度分别为3.54±0.7μmol·L-1、4.60±0.4μmol·L-1，高于Control组0.85±0.4μmol·L-1（P<0.01）、1.65±0.1μmol·L-1（P<0.01）；Gly、GABA的含量分别为4.24±0.5μmol·L-1、7.51±0.5μmol·L-1，高于Control组2.77±0.4μmol·L-1（P<0.01）、6.42±0.8μmol·L-1（P<0.05），而GABA/Glu为1.64±0.2，较Control组3.92±0.7降低（P<0.01）。PHC、Sco组均能提高此比值，分别是H/R组的2.38（P<0.01）、1.27倍，并且PHC组与Sco组比较有统计学意义(P<0.01)，提示PHC能减少脑缺血后兴奋性氨基酸的释放，减轻缺血性脑损伤。
　　 2.4 PHC对大鼠海马脑片缺氧缺糖/复氧复糖损伤后凋亡相关蛋白表达的影响在海马脑片CA1区，H/R组Bcl-2，Bax，Caspase-3阳性细胞表达均显著高于Control组(均P<0.01), 而Bcl-2/Bax比值显著低于Control组（P<0.05）；PHC组Bcl-2阳性细胞的表达和Bcl-2/Bax比值均较H/R组升高(P<0.01,P<0.01), Bax和Caspase-3 阳性细胞表达均较H/R组降低(P<0.01,P<0.01)。Sco组Bcl-2阳性细胞的表达和Bcl-2/Bax比值也较H/R组升高(P<0.05，P<0.01), Bax和Caspase-3 阳性细胞表达均较H/R组降低(P<0.01,P<0.01)。与Sco组相比，PHC对以上指标的影响能力均大于Sco（P<0.01）。
　　 结论:
　　 在本实验条件下得出以下结论：
　　 1.PHC 降低大鼠海马脑片缺氧缺糖/复氧复糖损伤后LDH释放率，提高其TTC染色后OD490值、降低组织损伤百分率，改善病理性损伤，对大鼠海马脑片缺氧缺糖/复氧复糖损伤显示出明显的保护作用。
　　 2.PHC下调大鼠海马脑片缺氧缺糖/复氧复糖损伤后pERK1/2和cPLA2蛋白表达量，减少兴奋性氨基酸的释放和提高GABA/Glu比值。
　　 3.PHC减少大鼠海马脑片缺氧缺糖/复氧复糖损伤后凋亡相关蛋白Caspase-3、Bax的表达，增加凋亡相关蛋白Bcl-2的表达，从而减轻大鼠海马脑片缺氧缺糖/复氧复糖后神经元的凋亡。