阳离子磷酸胆碱聚合物负载siRNA抑制乙肝病毒复制的实验研究

摘要

目的:
　　 (1)研究新型阳离子磷酸胆碱聚合物(MPC30DEA70)能否作为携带小干扰RNA(siRNA)的载体,并进一步研究其发挥的生物学效应。
　　 (2)观察该载体携带针对乙型肝炎病毒(HBV)X基因的siRNA在细胞水平能否抑制HBV的复制。
　　 方法:
　　 ①DAPI染核及四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法分析MPC30DEA70对HepG2.2.15的细胞毒性。
　　 ②设计荧光素酶表达质粒的小干扰(siLUC),以无荧光标记的MPC30DEA70负载红色荧光标记的siLUC转染HepG2.2.15细胞,24、48 h后荧光显微镜下拍照并计算在该细胞中的转染效率。
　　 ③在此基础之上,检测48 h时转染细胞中的siLUC对荧光素酶基因表达的抑制效应。
　　 ④用同法转染针对HBV X基因的小干扰(siHBV X),RT-PCR法检测48 h后HBV mRNA水平的变化,并分别于24、48、72 h后用ELASA法检测细胞培养上清中的HBsAg,实时荧光定量RCR技术对HBV DNA进行定量检测。
　　 结果:
　　 ①在本实验设定的0.5、1、3、5 ug四个浓度下,MPC30DEA70对HepG2.2.15细胞的毒性较小,细胞存活率均在80％以上。
　　 ②MPC30DEA70负载siLUC在48 h的转染效率可达到(52.33±2.0)％,而脂质体负载的siLUC可达到(56.33±2.4)％。③48 h时转染HepG2.2.15细胞中的siLUC能够有效抑制荧光素酶质粒的表达。
　　 ③RT-PCR法证实48 h时以MPC30DEA70载体组siHBV X与内参β-actin条带灰度比值(1.14±0.1)与空白对照组(2.51±0.2)比较差异有统计学意义;与脂质体组(0.85±0.1)比较差异无统计学意义;MPC30DEA70负载siHBV X能够降低细胞上清液中HBsAg水平和HBV DNA的水平。72 h时检测值分别为(6.34±0.1)ng/ml和(4.00±0.3)×107 copics/ml,与空白细胞组的(22.86±1.5)ng/ml和(12.90±0.2)×107 copies/ml比较,差异有统计学意义。
　　 结论:
　　 (1)MPC30DEA70携带的siRNA能够进入HepG2.2.15细胞中且有着较高的转染效率;并发挥了一定的生物学效应,但抑制效果不及脂质体组。
　　 (2)MPC30DEA70携带的siRNA能够进入HepG2.2.15细胞中后能够使HBV mRNA水平下降,且与脂质体组相当。
　　 (3)该载体携带的针对HBV X基因的siRNA对HBsAg、HBV DNA有一定的抑制作用,但抑制效果不及脂质体组明显。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:缩略词表

前言

材料和方法

1.材料

2.实验方法

结果

讨论

结论

论文图片

参考文献

综述:RNA干扰抑制乙肝病毒复制及基因表达的研究进展

攻读硕士学位期间撰写学术论文题目

临床培训小结

致谢