大黄酸、大黄素诱导高糖状态下肾小球系膜细胞凋亡的比较性研究

摘要

目的：探讨大黄酸、大黄素对高糖状态下SD大鼠肾小球系膜细胞(Glomerularmesangial cell，GMC)凋亡的影响。
　　方法：在高糖状态下建立肾小球系膜细胞增殖病理模型，MTT法检验；用不同浓度的大黄酸(20，40，80μmol·L-1)、大黄素(20，40，80μmol·L-1)分别刺激高糖状态下GMC；HE染色(hematoxylin-eosin staining)观察细胞形态学变化；DAPI(4’，6-Diamidino-2-phenylindole，dihydrochloride)荧光染色观察细胞核凋亡情况；流式细胞仪检测细胞凋亡率。
　　结果：1、系膜细胞增殖模型的研制
　　25mmol/L的葡萄糖刺激24小时即显著地促进了系膜细胞增生，且这种作用在刺激48小时最为明显，说明系膜细胞增殖模型符合实验要求。
　　2、实验结果
　　2.1HE染色结果
　　与正常组比较，大黄酸组24h20μmol·L-1细胞碎片增多，凋亡细胞产生，细胞皱缩，胞膜完整，细胞核固化，密度增大，染色质凝聚，嗜碱性增强，细胞核染成深蓝色；48h时细胞已皱缩成团细胞核碎裂成多个颗粒，胞膜不完整；40μmol·L-1、80μmol·L-1，细胞严重皱缩成细长形，贴壁细胞数明显减少，胞核变小且密度增大，染色质凝聚，嗜碱性增强，染成深蓝色；48h时，视野内细胞数较24h减少更多，细胞皱缩成团，胞核破碎成多个颗粒，胞膜不完整。大黄素组24h20μmol·L-1细胞形态没有明显变化；40μmol·L-1时凋亡细胞产生，细胞皱缩但胞膜完整，胞核固化，密度增大，染色质凝聚，嗜碱性增强，胞核染成深蓝色；80μmol·L-1，细胞皱缩成团，细胞数减少，碎裂成颗粒的细胞核增多；48h40μmol·L-1时，细胞皱缩，细胞数减少，部分细胞核碎裂成颗粒，胞质浓染；80μmol·L-1时视野内已找不到完整细胞核。
　　与大黄素组比较：24h、48h大黄酸低、中、高浓度细胞形态的改变较大黄素组明显。
　　2.2DAPI染色结果
　　与正常组比较：大黄酸组24h20μmol·L-1时部分细胞核染色质出现浓缩状态，40μmol·L-1时细胞核裂解为碎片，完整细胞核较少，80μmol·L-1时基本没有完整细胞核存在；48h20μmol·L-1时部分细胞核裂解为碎片，40μmol·L-1时完整细胞核较少，80μmol·L-1视野内很难找到完整细胞核。大黄素组24h20μmol·L-1时细胞核无明显变化，40μmol·L-1完整细胞核减少，80μmol·L-1产生凋亡小体；48h20μmol·L-1时，部分高度凝聚，未见细胞碎片，40μmol·L-1完整细胞核相对减少，20μmol·L-1时镜下很难找到完整细胞核。
　　与大黄素组比较：随着时间及剂量的增加，大黄酸低、中、高浓度组对细胞核的影响程度均强于大黄素各组。
　　2.3凋亡率检测结果
　　24h时，细胞早期凋亡率与正常组比较：大黄酸高浓度组有统计学意义，p<0.05。
　　24h时，细胞晚期凋亡率和坏死细胞率与正常组比较：大黄酸低、中、高浓度组均有统计学意义，p<0.05；大黄素高浓度组有统计学意义，p<0.05。
　　24h时，细胞早期凋亡率组内比较：与高浓度组比较，大黄酸低、中浓度组、大黄素高浓度组有统计学意义，p<0.05。
　　24h时，细胞晚期凋亡率和坏死细胞率组内比较：与低浓度组比较，大黄酸中、高浓度组、大黄素高浓度组有统计学意义，p<0.05；与中浓度组比较，大黄酸低、高浓度组均有统计学意义，p<0.05；与高浓度组比较，大黄酸、大黄素低、中浓度组均有统计学意义，p<0.05。
　　48h时，细胞早期凋亡率与对照组比较：大黄素中浓度组有统计学意义，p<0.05。48h时，细胞晚期凋亡率和坏死细胞率与对照组比较：大黄酸低、高浓度组有统计学意义，p<0.05；大黄素高浓度组均有统计学意义，p<0.05。
　　48h时，细胞晚期凋亡率和坏死细胞率组内比较：与低浓度比较，大黄酸高浓度组、大黄素高浓度组有统计学意义，p<0.05；与中浓度组比较，大黄酸、大黄素高度组均有统计学意义，p<0.05；与高浓度组比较，大黄酸低、中浓度组、大黄素低浓度组均有统计学意义，p<0.05。
　　结论：大黄酸、大黄素均有诱导高糖状态下SD大鼠肾小球系膜细胞凋亡的作用，且大黄酸优于大黄素，并呈剂量依赖性。