shRNA沉默XIAP基因对人前列腺癌细胞DU145增殖和凋亡的影响

摘要

目的：构建靶向XIAP短发夹RNA(short hairpin RNA， shRNA)重组质粒载体并转染人前列腺癌DU145细胞株，观察其转染效率及对人前列腺癌XIAP基因表达及其增殖、凋亡的影响。研究为针对XIAP基因的RNA干扰提供新的有效的作用靶位，为针对凋亡抑制基因XIAP的前列腺癌基因治疗提供新的途径。
　　 方法：1．设计3对针对XIAP基因不同位点的shRNA片段，构建携带此shRNA片段的真核表达载体pGPU6/GFP/Neo-XIAP-shRNA，分别命名为XIAP-shRNA1、XIAP-shRNA2、XIAP-shRNA3，进行酶切及测序鉴定。2．前列腺癌DU145细胞培养、传代。通过荧光显微镜观察XIAP-shRNA和脂质体（LipofectaminTM2000）以不同比例转染前列腺癌细胞后细胞存活情况并优化转染效率。3．通过脂质体转染三组质粒，并设置空白对照组、阴性对照组，收集转染48小时后的DU145细胞提取总RNA和总蛋白，RT-PCR和Western blot技术分别检测XIAPmRNA及蛋白表达水平，计算抑制率，筛选有效靶点。4．将筛选出的重组质粒XIAP-shRNA2转染DU145细胞，采用四甲基偶氮唑蓝法(MTT)测定DU145细胞生长抑制率；流式细胞术检测DU145细胞凋亡率。
　　 结果：1．酶切结果表明，所有质粒均为阳性重组质粒，测序结果表明碱基序列与设计的碱基序列完全一致，证实shRNA准确完整地导入质粒pGPU6/GFP/Neo。2．当质粒与脂质体比例1μg:2μl时转染率最高。48h细胞存活状态最好。3.RT-PCR和Western blot结果显示，与空白对照组相比，三组重组质粒对XIAPmRNA和蛋白均有不同程度的抑制作用（P＜0.05），其中以XIAP-shRNA2的抑制作用最强，对XIAP基因mRNA和蛋白抑制率分别为(63.0±1.39)％和(59.9±42.99)％。4.XIAP-shRNA2转染组细胞生长抑制率明显高于各对照组(P＜0.05)，凋亡率明显高于各对照组（P＜0.05）。
　　 结论：本研究成功构建并筛选出1个高效且特异阻断XIAP基因表达的RNA干扰重组质粒表达载体XIAP-shRNA2，对DU145细胞具有较高转染效率。XIAP与前列腺癌细胞的增殖和凋亡密切相关，抑制细胞中XIAP的表达可以抑制前列腺癌细胞的增殖，促进前列腺癌细胞凋亡。

目录

文摘

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前言

材料和方法

1 材料

2 方法

结果

讨论

结论

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参考文献

XIAP简介及其与肿瘤关系的研究现状 综述

参考文献

攻读硕士学位期间发表学术论文

临床培训小结

致谢