实验性自身免疫性重症肌无力大鼠外周血淋巴细胞microRNA表达谱研究

摘要

目的：探讨微小RNA(microRNA)在实验性自身免疫性重症肌无力(EAMG)大鼠外周血淋巴细胞中的特异性表达，并进一步作microRNA靶基因预测。
　　方法：1.12只雌性Lewis大鼠，SPF级，6-8周，体重150-180g，随机分组为EAMG组8只和对照组4只。EAMG模型的建立：首先制备抗原乳剂，具体流程如下：以生理盐水(normal sodium，NS)溶解大鼠AchR97-116肽段，再与卡介苗(结核分枝杆菌菌株H37Ra)及完全弗氏佐剂(CFA)充分混匀成乳剂(其中AchR97-116肽段浓度为50μg/200μl，卡介苗浓度为1mg/ml。免疫部位：双后肢足掌皮下。对照组：只接受等量完全弗氏佐剂(CFA)与生理盐水(NS)混合乳剂，于双后肢足掌皮下免疫。免疫部位：双后肢足掌皮下。对照组：只接受等量完全弗氏佐剂(CFA)与生理盐水(NS)混合乳剂，于双后肢足掌皮下免疫。依照Lennon评分标准[1]，利用双盲法对两组鼠每天进行体重测量和行为学观察。2.当EAMG组大鼠临床评分达到2分时进行实验研究，分别对EAMG组和对照组大鼠进行颈动脉采血，密度梯度离心法(Ficoll法)分离外周血单核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cells，PBMCs)。采用microRNA基因芯片和定量PCR技术分析并验证EAMG大鼠PBMCs的microRNA表达谱。3.构建第二批EAMG组和对照组模型后，分离出PBMCs，并进一步经MACS负性分选CD4+T细胞，流式细胞仪检测CD4+T细胞分选纯度(当CD4+T细胞分选纯度>90％时，符合进一步实验标准)。根据芯片分析结果，选取兴趣microRNA，应用实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR，Q-PCR)技术分析CD4+T细胞兴趣microRNA表达。4.运用生物信息学预测兴趣microRNA的靶基因并用荧光素酶实验验证。
　　结果：1.EAMG模型组大鼠免疫后出现两个发病时相，分别开始于免疫后第1天、第28天左右，并分别于第7天和第56天达到发病高峰，且仅极少数发生死亡。早期发病时相疾病严重程度较轻微，低于1分(Lennon评分标准)，属于一过性发病且维持时间短暂，在此期间伴随着体重的轻度下降；晚期发病时相开始于第1次免疫后49天，并逐渐加重，表现为消瘦、震颤、活动无力、撕咬无力、弓背低头垂尾姿势、甚至全身衰竭等。CFA大鼠免疫则未出现明显的上述症状。发病第7天EAMG组(159.0±2.5)g，对照组为(158.8±3.8)g(P>0.05)，两组大鼠体重比较差异无统计学意义(P>0.05)。发病第56天EAMG组(150.0±4.5)g，对照组为(210.8±4.4)g，两组大鼠体重比较差异有统计学意义(P<0.05)。2.microRNA基因芯片结果显示：11个microRNAs在EAMG组中表达差异显著，有统计学意义(P<0.05；P<0.01)：8个miRNAs(miR-24、miR-151、miR-423、miR-181c、miR-145、miR-326、miR-143和miR-328a)表达下调，3个miRNAs(miR-101a、miR-193和miR-33)表达上调。3.Q-PCR检测EAMG组和对照组大鼠淋外周血巴细胞和CD4+T细胞miR-145表达，结果显示miR-145在EAMG大鼠外周血淋巴细胞表达明显降低(P<0.05)，而在CD4+T细胞则显著降低(P<0.01)。4.生物信息学分析显示并经荧光素酶实验证实：T细胞激活所需的重要共刺激分子CD28是miR-145的下游靶基因。
　　结论：在EAMG外周血淋巴细胞中microRNA存在异常表达，提示microRNA在EAMG发病机制中发挥重要作用。同时我们利用生物信息学发现，CD28分子是miR-145的一个新的靶基因。在EAMG中，miR-145表达下调可能使其抑制CD28的作用减弱，进而促进T细胞的异常活化。miR-145可能作为一个潜在的治疗靶点，对治疗人类MG具有重大的意义。